半合成-酶连法克隆EFsec基因及其初步表达分析

李 丽 朱贵明 汪坤福 张鹏霞 (佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

硒蛋白(selenoprotein)是一类含有硒代半胱氨酸(selenocysteine，Sec)的特殊蛋白质，广泛存在于各种生物中。在哺乳动物中，硒蛋白不仅是硒的主要存在形式，也是主要的生物学功能形式。硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都有显著的作用〔1～3〕，硒蛋白尤其是哺乳动物硒蛋白的生物合成机制十分复杂，因为Sec的编码密码子(UGA)就是正常情况下的终止密码子，其解码需要一系列复杂的反式作用因子以及顺式作用元件的相互作用才得以完成;而且，硒蛋白的翻译效率很低〔4，5〕。Efsec，即真核硒代半胱氨酸-tRNA 特异性延伸因子是其中一个重要的反式作用因子，推测其在细胞质中先与硒代半胱氨酸-tRNA结合，因为Efsec具有核定位序列(NLS)，故能够携带硒代半胱氨酸-tRNA进入细胞核，然后再与其他反式作用因子共同作用，将硒蛋白中编码硒代半胱氨酸的密码子UGA进行解码〔6～8〕。为了深入研究Efsec在UGA解码中的作用以及提高硒蛋白的基因工程表达效率，本文采用酶连-半合成法克隆EFsec基因并将其连入哺乳动物表达载体pcDNA3.1，然后转染哺乳动物细胞HEK293T进行初步表达分析，为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌 TOP10、HEK293T细胞和质粒 pcDNA3.1(-)为本实验室所保存。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Pfu高保真酶、RT-PCR试剂盒等均购于宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒等均购于天根生化科技(北京)有限公司。转染试剂LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。细胞培养所用培养基、血清、培养皿等为Hyclone产品。

1.2 方法

1.2.1 Efsec基因的拼接策略和设计 质粒pOTB7-EFsec为本实验保存。质粒中插入目的基因EFsec来源于人的cDNA(GenBank ACCESSION No.BC007933)，克隆位点为EcoR I和Xho I。但该基因在5'端缺失一小段编码的碱基序列，约90 bp，需要补齐才具有正常的功能。经过酶切位点分析发现，在该基因的5'端存在一个天然酶切位点BssHⅡ，因此将缺失的约90 bp的序列(实际上包括20 bp的错误序列)连同其后的约100 bp的序列通过人工合成，这样获得一段总长约190 bp的人工合成的基因片段。合成的基因片段通过BssHⅡ酶切位点与缺失的Efsec基因片段(命名为Efsec-)相连接而补齐，即可获得完整的Efsec基因。见图1。

图1 Efsec基因拼接策略和设计

1.2.2 基因片段的合成、拼接与克隆 190 bp的基因片段委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，合成的基因片段克隆到pMD18-T载体。合成的190 bp片段用SphⅠ和BssHⅡ从pMD18-T中切下来，而Efsec-基因片段从pOTB7-EFsec质粒中用BssHⅡ和BglⅡ切下来(大小为2 000 bp，含3'UTR)，然后将两者做连接，再以连接产物为模板采用PCR方法扩增出ORF序列。扩增时使用的PCR引物已加酶切位点(BamHⅠ，EcoRⅠ)：上 游 引 物 LefsecR-2：5'ACTGGATCCATTATGGCAGGGCGGCGGGTG 3';下游引物 LefsecR-α：5'TGCGAATTCTGGGGGAGGTCACCGGACACTC 3'。经过酶切后可连接到真核表达载体pcDNA3.1(-)，从而获得该基因的表达质粒pcDNA3.1-EFsec。该质粒经测序验证是否符合预期，确保未发生突变。上述有关酶切、连接、转化、质粒提取、PCR等主要参照《分子克隆》中的方法进行。

1.2.3 重组质粒有效性初步鉴定 在完成基因拼接和pcDNA3.1-Efsec质粒构建后，为了初步检验该质粒的有效性，采用脂质体(瞬时)转染的方法转染HEK293T细胞，在转染后第3日收集细胞，提取总RNA，并以RT-PCR方法检测Efsec情况，PCR 引物为 Efg-s：5'CTTTGACAAGCAGCCGCAGAG 3'和 Efg-a：5'TGGGATGGAAATCTGGGACG 3'，扩增产物大小为540 bp。

2 结果

2.1 190 bp基因小片段的合成及其与EFsec－基因片段的拼接、克隆 190 bp基因小片段合成后连入pMD18-T载体，经过测序验证无误。然后按照上述实验方法将该基因片段以及EF-sec-基因片段分别切下来，连接，并使用LefsecR-s和LefsecR-a引物扩增。PCR扩增时使用了Teq酶和Pfu酶分别进行实验，只有Pfu酶扩增获得良好结果。扩增的产物为完整EFsec基因的编码框部分，大小约1 800 bp(图2A)。PCR产物经过回收、酶切，连接到pcDNA3.1(-)载体，转化大肠杆菌TOP10后涂板，将长出的细菌克隆随即挑选数个用以鉴定重组质粒，将其中4个提取质粒做大小鉴定，均为阳性克隆(图2B);再从这4个质粒中取3、4号做酶切鉴定，再次确认为重组克隆(图2C)，最后经测序证明这两个克隆完全正确并无突变产生(图3)。

图2 pcDNA3.1-EFsec表达质粒的构建

2.2 通过转染HEK293T细胞初步鉴定重组质粒的有效性将pcDNA3.1-EFsec表达质粒用于转染，转染时利用 pcDNA3.1-GFP质粒进行对照，其绿色荧光可比较准确地反映转染效率。转染后第2天观察细胞，结果表明转染实验是成功的(图4)。然后收集细胞提取总RNA做RT-PCR实验，结果表明转染pcDNA3.1-EFsec质粒的细胞中EFsec基因发生了大量的表达，而正常HEK293T细胞以及pcDNA3.1-GFP对照转染的细胞则未能检测到EFsec基因发生了大量的转录表达。这就意味着该基因在培养条件下的细胞中是不表达的，但其重组质粒转染后则发生强制性的表达，说明成功构建表达质粒。

图3 pcDNA3.1-Efsec重组质粒的测序鉴定(局部)

图4 pcDNA3.1-EFsec重组质粒有效性鉴定

3 讨论

EFsec在Sec通过特殊翻译机制参入到硒蛋白的过程中起着重要作用，是Sec的编码密码子UGA正确解码的一个关键的反式作用因子〔6，8〕。而本实验室所保存的pOTB7-EFsec质粒中插入的EFsec-由于缺失一段碱基而并不是一个完整的功能正常的基因，因此在研究EFsec基因在硒蛋白生物合成中的作用机制前需要将它补齐。对于较短的基因片段，采取人工合成是优先选择，既快捷又经济。那么基因片段如何破解呢?很多实验的做法是采取退火方法，使相互有局部重叠的两个片段在退火时完成拼接。这种办法发生错配的概率不小，会造成一些突变，从而需要修正，甚至是反复的修正。本研究的策略是利用基因序列中突然存在的酶切位点来拼接基因片段，这种方式可以说不存在拼接中发生突变的可能，而且也是比较方便快捷的方法。在确定拼接酶切位点时需要注意的是应该选择离拼接一段尽可能近的位点，并且选择常用的限制性内切酶。酶连后采用PCR扩增的方法也是本实验中证明极其有效迅速的方法，当然必须要选择高保真酶，确保PCR扩增不出现突变。

将连接后的PCR扩增产物即完成拼接的EFsec基因片段连接到真核表达载体pcDNA3.1(-)获得正确的重组质粒后，本研究将其转染了哺乳动物细胞HEK293T，用以验证基因及其重组质粒的有效性，结果发现本来在正常培养条件下的HEK293T细胞中不表达的EFsec基因获得了强制性表达，说明表达载体构建是成功的。另外，在正常培养条件下HEK293T细胞中不表达EFsec基因，这正好说明EFsec的特殊性，即它完全是为硒蛋白的合成而存在的。实际上，硒蛋白的合成必须要在硒元素存在时才发生，而体外培养细胞时缺乏硒元素〔9〕。这就说明，硒可能直接或间接地调节EFsec的表达。总之，本研究提供了一种有效的、准确快捷的基因拼接策略和方法，克隆了功能完善的EFsec基因并进行了初步表达分析，为下一步的研究奠定了基础。

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