BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

张艳平 (常德职业技术学院医学系，湖南 常德 415000)

BHRF1基因是凋亡抑制基因，其编码的蛋白能通过多种途径抑制细胞凋亡的发生，最终导致细胞癌变。BHRF1蛋白与鼻咽癌的发生发展有很大关系，这对鼻咽癌的诊断、治疗和预后具有重要意义。基因载体的选择与构建合适的载体系统是基因治疗的关键之一〔1〕。慢病毒(LV)不仅具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，还进一步提高了基因表达的安全性〔2，3〕。本研究中构建BHRF1表达载体，以期在真核细胞中高效、稳定表达，从而为进一步从分子水平探讨BHRF1分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及细胞 大肠杆菌TOP10购于华美生物工程公司;LV包装体系pWPXL Lentivector Packaging Kit(质粒pWPXL-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG)购自美国System Biosciences公司;293T细胞购自中国科学院典藏细胞委员会细胞库。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶EcoR I、Mlu I，T4连接酶及DNA聚合酶购于TaKaRa公司;Trizol total RNA试剂盒、PCR反应试剂盒、质粒小抽试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等分别购于Axrgen公司和TOYOBO公司;Lipofectamine2000购于Invitrogen公司，DMEM培养基及小牛血清购于Hyclone公司;主要试剂为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 BHRF1基因的一对扩增引物如下：BHRF1-前向：5'-GGAATTCTTACATGGCGCTAACCTCCATC-3'，BHRF1-反向：5'-CGGGATCCTGCTGTCAACTCCAACACAGGATGCAAAC C-3'。上游引物均从5'开始，添加了EcoR I酶切位点(GAATTC)，下游引物均从 5'开始，添加了 BarnH I酶切位点(GGATCC)。引物由北京鼎国公司合成。

1.2.2 BHRF1基因RT-PCR扩增 将收集保存于液氮中的鼻咽癌组织标本取出后迅速放入干冰中，在样品冰冻的状态下，切取、称量1 mg，添加1 ml 4℃预冷的Trizol，在冰上进行组织研磨，参照Trizol total RNA试剂盒说明书，采用一步法提取鼻咽癌组织中的总RNA后再逆转录为cDNA。以BHRF1基因cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增体系：10×缓冲液 5 μl，MgSO4(50 mmol/L)2 μl，Template(plasmid DNA)1 μl，Taq HiFi(5 U/μl，Invitrogen)0.2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)1 μl、dNTP(10 mmol/L)1 μl，加 ddH2O 至 50 μl。PCR 循环反应条件：94℃预变性 3 min;94℃ 30 s，56℃ 1 min，68℃ 1 min 10 s，共35个循环;最后72℃延伸10 min。反应结束后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

1.2.3 BHRF1基因的LV表达载体的构建 回收纯化PCR产物，用限制性内切酶EcoR I、Mlu I分别双酶切PCR产物与LV表达载体，T4 DNA连接酶将回收纯化的PCR产物连接于线性化的LV表达载体中。连接体系为：10×T4连接酶缓冲液1 μl，T4 连接酶 1 μl，目的片段 2 μl，pWPXL-IRES-GFP 病毒 1 μl，补ddH20至10 μl，16℃连接过夜。将5 μl连接产物转化至TOP10感受态细胞，37℃ 250/min振荡培养45 min。收集菌液，取200 μl涂布于LB平皿中，37℃倒置培养过夜。挑取单个菌落，限制性内切酶对重组质粒进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。阳性克隆送上海生工技术有限公司测序。

1.2.4 LV颗粒的制备 培养293T细胞，并于感染前1 d接种到直径10 cm的培养皿，采用磷酸钙沉淀法将LV载体三质粒细胞包装系统(表达质粒pWPXL-hBHRF1-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG)共转染293T细胞。转染后24 h，用含1%小牛血清白蛋白(FBS)的DMEM换液转染48 h后，收集病毒上清，4℃下50 000 r/min离心2.5 h沉淀病毒颗粒，弃上清，1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬病毒，10 μl/EP管进行分装，－70℃保存。

1.2.5 LV滴度的测定 293T细胞用含有10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。转染前1 d以2×105/孔接种入6孔板中，孵箱中培养至细胞50%融合。弃去细胞培养液，按阶梯稀释法将LV液稀释10－1～10－5共5个浓度(终体积1 ml)，分别加至6孔板中。病毒滴度测定：72 h后荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数以计算病毒滴度(病毒滴度=GFP阳性细胞率×细胞总数/LV液体积×LV液稀释倍数)(TU/ml)。取各组平均值计算滴度。

2 结果

2.1 BHRF1 cDNA的鉴定结果 以BHRF1 cDNA为模板进行PCR扩增，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析鉴定PCR产物：电泳图中可见PCR扩增的780 bp大小的目的片段，初步判定PCR扩增出BHRF1全编码序列。DNA测序结果显示目的基因扩增正确，无碱基突变及缺失。见图1。

图1 RT-PCR结果

图2 重组慢病毒鉴定结果

2.2 重组LV表达载体pWPXL-hBHRF1-IRES-GFP的构建及鉴定 重组质粒转化TOP10感受态细胞，挑取单个菌落进行菌落PCR，限制性内切酶Mul I及EcoR I对PCR产物进行双酶切鉴定结果：可见780 bp大小的目的条带和LV表达载体载体pWPXL-IRES-GFP片段，说明Atoh1已经重组于pWPXL-IRESGFP vertor内，再次测序结果表明目的基因插入方向和序列完全正确，证明重组LV表达载体构建成功。见图2。

2.3 LV载体系统的鉴定 取病毒上清感染293T细胞24 h后，荧光显微镜下可观察到大量GFP表达，荧光蛋白表达效率达90%，确定病毒滴度为1.0×108ifμ/ml。提示重组LV在体外培养条件下能使真核细胞显著表达外源基因。见图3。

图3 慢病毒上清感染293T细胞后24 h荧光检测(×100)

3 讨论

BHRF1基因所编码的BHRF1蛋白分子A链 (类型为多肽)，长度为173，BHR F1蛋白分子 B链片段长度从1～160。Bcl-2基因属于细胞凋亡因子，也是细胞存活促进因子，属膜整合蛋白，分子量为26 kD，定位于线粒体、内质网和连续的核周膜。BHRF1基因所编码的BHRF1蛋白与Bcl-2基因所编码的Bcl-2蛋白有很高的同源性，其功能也有很高的相似性〔4〕。有研究显示bcl-2基因与鼻咽癌尤其是晚期癌细胞转化密切相关，同时还提示bcl-2基因表达有促进淋巴结转移的作用〔5〕。然而BHRF1基因是否参与了鼻咽鳞癌细胞凋亡调节，需要进一步研究证实。

基因载体的选择与构建合适的载体系统是基因治疗的关键之一。目前在以基因治疗为目的的载体系统中，病毒载体显得格外令人关注〔6〕。本课题所选用的LV不仅具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因表达时间长、转移基因片段容量较大、不易诱发宿主免疫反应等优点，还进一步提高了基因表达的安全性〔7〕。不仅克服了以往逆转录病毒表达沉默的缺陷，而且转基因的效率远远高于传统的显微注射法，是转基因研究领域的突破性进展。

为了更进一步探索BHRF1基因对在鼻咽癌的作用机制及生物活性，本实验正确扩增出BHRF1基因全长编码序列，并成功构建带有荧光标记的LV表达载体。包装后的LV转染293T细胞，显微荧光静下观察到荧光蛋白表达，转染效率达90%，表明所构建LV颗粒可高效转染真核细胞，这为进一步研究BHRF1基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。

1 赵世巧，冯文莉.基因治疗的病毒载体研究进展〔J〕.国外医学·临床生物化学与检验学分册，2005;26(10)：709-11.

2 Gilad AA，Winnard PT Jr，van Zijl PC，et al.Developing MR reporter genes：promises and pitfalls〔J〕.NMR Biomed，2007;20(3)：275-90.

3 Mandel RJ，Burger C，Snyder RO.Viral vectors for in vivo gene transfer in Parkinaon's disease：properties and clinical grade production〔J〕.Exp Neurol，2008;209(1)：58-71.

4 欧阳为明，张继帅，金伯泉.PCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定〔J〕.第四军医大学学报，2003;24(2)：131-2.

5 Pang J，Cheng M，Haire SE，et al.Efficiency of lentiviral transduction during development in normal and rd mice〔J〕.Mol Vis，2006;12：756-67.

6 Sinn PL，Sauter SL，McCray PB Jr.Gene therapy progress and prospects：development of improved lentiviral and relroviral vectors-design biosafety and production〔J〕.Gene Ther，2005;12(14)：1089-98.

7 Kim BH，Han YS，Choe BK，et al.The escape of temperature-sensitive T antigen immortalized rat hepatocytes from conditional immortalization〔J〕.Cell Transplant，2005;14(7);507-17.