法舒地尔对家兔脊髓缺血再灌注损伤的影响

周青珍 阎平建 韩 琦 王 峥 佟德华 胡 博

脊髓损伤作为严重的神经系统疾病往往导致肢体截瘫、肢体感觉及括约肌功能障碍等，严重影响患者生活质量，甚至导致呼吸肌麻痹而危及生命，给个人、家庭及社会带来极大的痛苦与沉重的负担。过度的炎性反应是脊髓损伤的重要环节，法舒地尔是Rho激酶特异性抑制剂，具有明显的抗脑缺血及再灌注损伤作用［1～4］，但很少有脊髓缺血再灌注损伤方面的报道。本实验在成功建立脊髓缺血再灌注损伤模型基础上，探讨法舒地尔对ICAM－1表达水平的影响及对脊髓缺血及再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 普通级日本大耳兔42只，雌雄不限，体重2～2.5 kg，由武汉生物制品研究所提供。

1.1.2 试剂与仪器 法舒地尔购自天津红日药业股份有限公司；细胞间粘附分子－1（ICAM－1）多克隆抗体购自美国Molecular Tag分子标记公司；免疫组化二抗染色试剂盒及DAB显色试剂盒购自美国ZYMED 公司；肌电图机购自丹麦维迪公司，型号：KEYTOINT。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及模型制备

42只家兔随机分为3组，即假手术组（n＝6）、模型组（n＝18）、法舒地尔组（n＝18），对模型组及法舒地尔组采用腹主动脉夹闭法［5］制作脊髓缺血再灌注模型：无菌条件下，采用仰卧位腹部正中切口，手术分离家兔腹主动脉，在左肾动脉分支起始部下方用动脉夹夹闭腹主动脉，45 min后取下动脉夹实现再灌注。根据再灌注时间又分为再灌注后3 d，7 d，14 d三个亚组（n＝6）；法舒地尔组术后每日腹腔注射法舒地尔10 mg／kg，模型组注射等量生理盐水，假手术组不予干预。于相应时间点处死家兔，取损伤脊髓，固定备用。假手术组3 d时麻醉处死取脊髓标本。

1.2.2 神经功能评分 术后立即对家兔按照Jacobs法［6］行后肢运动功能评级，具体标准为0 级：全瘫（针刺无反应）；1级：严重瘫痪，最小功能性运动（肌肉搐动）；2级：能进行功能性运动（受累肢体可负重），但不能齐足跳动，而有共济失调和轻瘫（跛行）；3级：能齐足跳动，但有共济失调和轻瘫；4级：齐足跳动、轻度共济失调和（或）轻瘫（奔跑但不够灵活）；5级：正常。实验前后运用肌电图分别对家兔进行后肢运动诱发电位（motor evoked potential MEP）潜伏期（P1）检测，记录电极安放在颅骨正中矢状线旁开4.0mm，冠状线下2.5 mm，刺激电极插入腓肠肌，刺激强度5 mA，频率4 Hz，波宽1.0ms的单方波。

1.2.3 ICAM－1免疫组化染色 家兔缺血45 min再灌注3 d，7 d及14 d时，评级及检测肌电图后麻醉并处死家兔，取损伤L1－L5 脊髓，固定，石蜡包埋，制备5μm 厚连续切片，按免疫组化ABC 步骤进行。每张切片随机采集5个400倍视野输入图像分析系统，观察ICAM－1阳性表达水平。

1.2.4 统计学处理

2 结 果

2.1 对脊髓缺血再灌注家兔神经缺失的影响

脊髓缺血灌注损伤后模型组家兔Jacobs评分与假手术组相比明显降低（P＜0.001），7 d亚组神经功能缺损最重；法舒地尔组家兔Jacobs评分与模型组相比明显升高（P＜0.01），而3 d、7 d、14 d三个亚组之间Jacobs评分相比差异明显（P＜0.05）（见表1）。

表1 各组家兔后肢Jacobs评分的影响（±s，n＝6，分）

表1 各组家兔后肢Jacobs评分的影响（±s，n＝6，分）

组别 Jacobs评分3 d 7 d 14d假手术组 5.00±0.00模型组 1.50±0.55 1.17±0.75 1.50±0.54法舒地尔组 2.00±0.63 2.17±0.75 2.67±1.03

2.2 对后肢运动诱发电位的影响

治疗后模型组及法舒地尔组运动诱发电位潜伏期P1较治疗前明显缩短（P＜0.001），（表2）。

表2 法舒地尔对运动诱发电位的影响（±s，n＝18，s）

表2 法舒地尔对运动诱发电位的影响（±s，n＝18，s）

组别 潜伏期P1治疗前 治疗后模型组 39.28±4.19 52.92±3.01法舒地尔组 38.22±5.50 44.74±5.16

2.3 对脊髓ICAM－1表达水平的影响

ICAM－1蛋白阳性染色为棕黄色，主要分布在微血管和毛细血管的内皮细胞。假手术组家兔脊髓血管内皮仅有微量的ICAM－1表达，模型组脊髓血管内皮ICAM－1表达明显增强，阳性血管数明显增多（P＜0.01），以7 d时表达最明显；与模型组相比，法舒地尔组脊髓ICAM－1表达相对减弱，阳性血管数相对减少（P＜0.01）（图1～3、表3）。

图1 假手术组（×400）

图2 模型组（×400）

图3 法舒地尔组（×400）

3 讨 论

脊髓缺血再灌注损伤后，与再灌注有关的急性炎症反应在继发性脊髓损伤中的作用日益受到重视［7］，细胞粘附分子是近年来发现的一类细胞表面的糖蛋白，参与正常组织形态和结构的维持，影响内皮细胞之间的连接以及细胞－基底膜之间的粘附，保证内皮细胞层的连续性通透屏障功能［8，9］。在机体免疫、炎症反应中粘附分子介导了白细胞的粘附和活化。血管内皮细胞表面的粘附分子包括ICAM－1，ICAM－2等，它们的表达与白细胞粘附到血管壁以及穿越内皮细胞现象有关。其中ICAM－1为比较重要的粘附分子，作为白细胞表面粘附分子CD11／CD18系统的配体，炎症时内皮细胞ICAM－1 表达量的升高介导了白细胞的活化及其与血管壁的紧密粘附，为白细胞进一步跨内皮游出提供了条件。正常情况下ICAM－1仅在脊髓微血管内皮细胞及星形胶质细胞低表达，但在一些炎症递质刺激下它们在血管内皮细胞的表达明显升高。本实验研究发现，在家兔脊髓缺血再灌注3 d时ICAM－1表达明显升高，在7 d时达高峰，在14 d时仍有较高水平表达。与此相符，神经功能缺损程度3 d时明显加重，7 d时达高峰，14 d 时仍有部分功能障碍。这说明ICAM－1的迟发表达增多，促进白细胞和血管内皮细胞的粘附、脊髓微循环障碍及血脊髓屏障通透性增加，加重脊髓损伤后缺血、水肿、炎症病理过程。

法舒地尔是Rho激酶特异性抑制剂，能够扩张动脉血管，拮抗细胞内钙离子抑制肌动－肌球蛋白的相互作用，可有效降低炎性细胞分泌炎性因子（IFN－γ、IFN－α、IL－8、IL－1β），并可抑制炎性细胞粘附和浸润。此外，Rho 激酶抑制剂还可通过抑制caspase－3而抑制神经元凋亡，甚至可以增加内源性神经干细胞分化增殖［10］。本实验也证实，经法舒地尔治疗后ICAM－1表达明显减少，后肢Jacobs评分较模型组明显减轻，运动诱发电位潜伏期P1明显缩短，随时间延长，治疗组各亚组之间神经功能缺损情况及ICAM－1表达有统计学意义，提示早期、足疗程应用法舒地尔治疗可减少炎症反应，最终减轻神经功能损害。法舒地尔对脊髓神经功能的保护作用机制可能为（1）法舒地尔能增加eNOS的表达，舒张血管增加局部血流量，延缓缺血组织进入不可逆的细胞死亡过程；（2）法舒地尔对缺血区神经元有直接的保护作用；（3）法舒地尔可以改善缺血区的微循环功能；（4）法舒地尔可以抑制缺血区白细胞的渗出，减轻炎症反应对神经组织造成的损伤。但是，经治疗家兔脊髓缺血／再灌注损伤14 d后仍有部分神经功能缺损，这说明脊髓缺血／再灌注后炎性反应仅是导致神经损伤的一种原因，仍有其他因素参与，有待进一步研究。

1 Rikitake Y，Kim HH，Huang Z，et al.Inhibition of Rho kinase（ROCK）leads to increased cerebral blood flow and stroke protection.Stoke，2005，36（10）：2251－2257.

2 Yamashita K，Kotani Y，Nakajima Y，et al.Fasudil，a Rho kinase（ROCK）inhibitor，protects against ischemic neuronal damage in vitro and in vivo by acting directly on neurons.Brain Res，2007，1154：215－224.

3 Yagita Y，Kitagawa K，Sasaki T，et al.Rho－kinase activation in endothelial cells contributes to expansion of infarction after focal cerebral ischemia.J Neurosci Res，2007，85（11）：2460－2469.

4 Satoh S，Utsunomiya T，Tsurui K，et al.Pharmacological profile of hydroxy fasudil as a selective Rho kinase inhibitor on ischemic brain damage.Life Sci，2001，69（12）：1441－1453.

5 伍亚民，王正国，朱佩芳，等.缺血损伤脊髓运动诱发电位的变化及其意义.第三军医大学学报，2000，22：294－296.

6 Jacobs TP，Shohami E，Baze W，et al.Deteriorating stroke model：histopathology，edema，and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbits.Stroke，1987，18：741－750.

7 Ip WK，Wong CK，Lam CW，et al.Tumour necrosis factor－alphainduced expression of intercellular adhesion molecule－1 on human endothelio cells is mediated by the activation of nuclear factorkappaB pathway.Clin Exp Allergy，2003，33（2）：241－248.

8 Braasch DA.Liu Y，Corey DR.Antisense inhibition of gene expression in cells by oligonucleotides incorporating locked nucleic acids：effect of mRNA target sequence and chimera design Nucleic Acids Res，2002，30（23）：5160－5167.

9 Steidl U，Haas R，Kronenwett R.Intercellular adhesion molecular 1 on monocytes mediates adhesion as well as trans－endothelial migration and can be downregulated using antisense oligonucleotides Ann Hematol，2000，79（8）：414－423.

10 郭爱华，孟建中.特异性Rho激酶抑制剂防治缺血性疾病的临床进展.生物医学工程研究，2010，29：202－205.