肥厚型心肌病左心室心肌纤维化及骨桥蛋白表达变化

汤大为，林国生，黄京璐，刘 超，郝 博，余彦耿，孔小平，权 力，廖信彪，罗 斌

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东 广州 510080；2.佛山市公安局南海区分局，广东 佛山 528000；3.广州市公安局刑事科学技术研究所，广东 广州 510030；4.广东省公安厅刑事技术中心，广东 广州 510050；5.广州市公安局番禺区分局，广东 广州 511400）

肥厚型心肌病左心室心肌纤维化及骨桥蛋白表达变化

汤大为1，林国生2，黄京璐1，刘 超3，郝 博1，余彦耿4，孔小平5，权 力1，廖信彪4，罗 斌1

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东 广州 510080；2.佛山市公安局南海区分局，广东 佛山 528000；3.广州市公安局刑事科学技术研究所，广东 广州 510030；4.广东省公安厅刑事技术中心，广东 广州 510050；5.广州市公安局番禺区分局，广东 广州 511400）

目的 研究肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）死者心肌间质纤维组织含量及心肌细胞中骨桥蛋白的表达，探讨骨桥蛋白在鉴定HCM致死案件中的法医学意义。 方法 选取15例HCM致死者左心室心肌为HCM组、15例冠心病心肌肥厚致死者左心室心肌为冠心病组及20例交通事故及高坠致死者左心室心肌为对照组，应用HE染色、Masson三色染色法和免疫组化法比较3组左心室心肌间质中胶原容积分数及心肌细胞内骨桥蛋白阳性表达的变化，并利用图像分析软件进行统计学分析。 结果 HCM组和冠心病组左心室心肌间质胶原容积分数高于对照组（P＜0.05），而HCM组与冠心病组差异无统计学意义（P＞0.05）；HCM组和冠心病组左心室心肌细胞骨桥蛋白阳性表达积分光密度值均高于对照组（P＜0.05），且HCM组高于冠心病组 （P＜0.05）。 结论 心肌间质胶原纤维含量的增高和骨桥蛋白过度表达可能在HCM心肌纤维化过程中发挥重要作用，可作为HCM致心源性猝死的辅助诊断指标。

法医病理学；心肌病，肥厚性；纤维化；骨桥蛋白质

肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是指无导致心肌异常负荷因素（如高血压、瓣膜病）而发生的心室壁增厚或质量增加的一种疾病。据估计，HCM在世界范围内的发病率约为0.2%[1]。HCM人群年死亡率约为1%[2]，是年轻人心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）的首位病因[3]。HCM的临床表现一般为呼吸困难、胸痛、心悸、晕厥及SCD。其中，SCD是HCM最严重的表现型，往往也是HCM致死者的首次症状表现[4-5]。

目前对HCM致死者的法医病理学诊断缺乏特异性的指标。近年来研究表明，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）可通过促进胶原沉积加速心肌重构的进程，在心血管重构发生发展中起着重要的作用[6]。本研究利用Masson三色染色法和免疫组化法观察左心室心肌组织中心肌纤维化及OPN的表达情况，探讨OPN在HCM致死案例鉴定中的法医学意义。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

收集2007年1月—2011年8月中山大学法医鉴定中心检案左心室心肌组织蜡块，选取心脏质量400g以上、HCM致死案件15例，作为HCM组；心脏质量400g以上、冠心病心肌肥厚致死案件15例，作为冠心病组；交通事故及高坠致死案件20例，作为对照组。

1.2 主要仪器及试剂

ExcelsiorTMES自动组织脱水机、Histocentre 3TM组织包埋机［美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司］，SM2000R石蜡切片机（德国Leica公司），DP70型荧光显微镜、DP-BSW软件（日本奥林巴斯公司），电热水浴箱（北京医疗器械厂），电热恒温箱（上海跃进医疗器械厂），艾柯实验室超纯水系统（成都唐氏康宁科技发展有限公司），Image-Pro Plus 6.0彩色医学图文分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

兔抗人OPN（分泌性磷酸化蛋白质-1）多克隆抗体、PBS粉剂、柠檬酸抗原修复液（武汉博士德生物工程有限公司），生物素标记的鼠兔通用快捷型抗体（福建迈新生物科技技术开发有限公司），Masson三色试剂盒（广州俪科贸易有限公司）。

1.3 固定、取材及切片

所有尸体低温保存1～3d内进行解剖检验，常规取材心脏经10%甲醛固定72 h后，于左心室前壁冠状沟下1cm处取左心室心肌组织，进行脱水、石蜡包埋，连续切片3张，厚度为4 μm，分别进行HE常规染色、Masson三色染色和OPN免疫组化法染色。

1.4 HE染色

将3组切片分别进行HE常规染色，光学显微镜下观察。

1.5 Masson三色染色

将3组切片在Bouin或Zenker液固定一晚，流水冲洗至无色，天青石蓝染色5min，Mayer’s苏木素染色5min，1%盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟，丽春红酸性品红液染5～10min，蒸馏水稍冲洗，1%磷钼酸水溶液处理5min，直接用苯胺蓝或亮绿染色5min，1%冰醋酸处理5 min，95%乙醇脱水多次，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光学显微镜下观察。

1.6 OPN免疫组化染色

将3组切片脱蜡，水化；3%甲醇过氧化氢溶液（80%甲醇）去除内源性过氧化物酶，室温静置15min；PBS洗片3次，每次5 min；高压热修复法（EDTA溶液，pH=8.0）修复抗原10min；PBS洗片3次，每次5min，滴加正常山羊非免疫血清，室温保湿孵育20 min；滴加兔抗人OPN（分泌性磷酸化蛋白质-1）多克隆抗体（1∶100稀释），空白对照组以PBS代替一抗，4℃保湿孵育过夜；37℃复温30min，PBS清洗3次；滴加生物素标记的鼠兔通用快捷型抗体，室温保湿孵育45min；PBS洗片3次，每次5 min，显微镜下观察DAB显色（约1min）；苏木素复染1min，1%盐酸-乙醇分化，自来水中返蓝30min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察。

1.7 心肌间质胶原容积分数计算

Masson三色染色以蓝色胶原沉积为阳性信号，光镜下心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。每张切片随机选取5个不重复的视野（×200倍）进行拍照。用Image-Pro Plus 6.0软件对图像进行分析，计算心肌间质胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。CVF=胶原面积/全视野面积，取均值。

1.8 心肌细胞OPN阳性表达判定及积分光密度计算

心肌细胞中OPN阳性表达呈深棕黄色颗粒状。每张切片随机选取5个不重复视野（×400倍）进行拍照。用Image-Pro Plus 6.0软件对图像进行分析。计算心肌细胞内OPN阳性表达的积分光密度（integral optical density，IOD），取均值。

1.9 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件分析数据，以上两组计量资料均以±s表示，分别进行单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 HE染色结果

对照组：心肌横纹尚清，部分心肌纤维断裂或呈波浪状排列，未见坏死及炎症细胞浸润；间质血管扩张、充血（图1A）。冠心病组：心肌横纹欠清，部分心肌纤维断裂或呈波浪状排列，间质内见多个陈旧性梗死小灶，伴有少量炎症细胞浸润（图1B）。HCM组：心肌细胞肥大，细胞核形态巨大、畸形（图1C），间质中增生的纤维结缔组织将心肌分隔成束状及旋涡状排列（图1D）；心肌血管壁增厚，管腔缩小，周围见毛细血管增生。

图1 3组心肌组织HE染色结果

2.2 Masson三色染色结果

对照组：心肌细胞呈红色，细胞横切面积未见异常，间质内见少量蓝色胶原纤维（图2A）。冠心病组：心肌细胞呈红色，部分细胞横切面积增大，间质内见蓝色胶原纤维灶性形成（图2B）。HCM组：心肌细胞呈红色，多数细胞横切面积肥大，间质内见大片蓝色胶原纤维组织增生，并围绕个别心肌呈旋涡状排列（图2C）。

应用Image-Pro Plus 6.0软件对Masson三色染色的图片进行分析，结果显示HCM组心肌间质中CVF（0.226±0.028）和冠心病组心肌间质中CVF（0.252± 0.071）较对照组心肌间质中CVF（0.085±0.017）均有增高（P＜0.05），而HCM组和冠心病组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 OPN免疫组化染色结果

对照组：少量心肌细胞内OPN阳性表达（图3A）；冠心病组：心肌细胞内OPN阳性表达增多（图3B）；HCM组：心肌细胞内OPN阳性表达显著增多（图3C）。

图2 3组心肌组织Masson三色染色结果 ×200

图3 3组心肌组织OPN免疫组化染色结果 ×400

应用Image-Pro Plus 6.0软件对OPN免疫组化染色图片进行分析，结果显示HCM组、冠心病组及对照组的心肌细胞中OPN阳性颗粒达均有不同程度表达，HCM组OPN阳性表达IOD（259103±26850）和冠心病组OPN阳性表达IOD（125 066±32 521）均较对照组（56 301±28 023）增高（P＜0.05），且HCM组也高于冠心病组（P＜0.05）。

3 讨 论

HCM被认为是一种常染色体显性遗传性疾病，发病机制尚不明确[7]。HCM可呈家族性发病，也可散发性发病。在法医实际检案中，由于HCM致死者通常无任何临床症状下突然死亡，死者家属往往无法接受，对死因争议较大。然而法医工作者在对其进行死因鉴定时，往往缺乏相关临床资料，只有通过尸体解剖，先排除暴力或其他疾病致死的可能，把心脏外观增大、心室肌肥厚以及心肌组织学改变作为诊断HCM的主要鉴定依据[8]。

3.1 HCM心肌纤维化的法医学意义

心肌纤维化是指在心肌组织结构中胶原纤维过量积聚、胶原浓度显著升高或CVF显著增加[9]。从总体上讲，心肌纤维化是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果，形成机制非常复杂。本实验采用Masson三色染色法首先对HCM组、冠心病组及对照组左心室心肌胶原纤维进行特殊染色，结果显示，HCM组和冠心病组中CVF较对照组均有明显增高，而HCM组与冠心病组两组之间的CVF差异无统计学意义。同时也发现，HCM组与冠心病组的肥厚心肌组织经特殊染色后心肌纤维化程度差异无统计学意义，这可能是由于HCM和冠心病心肌肥厚均可导致心肌间质胶原纤维含量的增生，所以心肌纤维化被认为是HCM和冠心病发展到某一阶段共同的病理形态学改变。心肌纤维化是一个复杂的病理过程，需要肾素-血管紧张素-醛固酮系统、免疫系统以及多种细胞因子的参与，心脏疾病可导致心肌纤维化，进而发展为心肌肥厚、心肌硬度增加、心室舒张功能障碍，最终可引发心力衰竭甚至SCD。因此，本实验结果提示，心肌纤维化这一形态学改变可作为HCM与正常心肌组织的辅助鉴别指标，但对于HCM与心肌肥厚的冠心病心肌组织，不能根据心肌纤维化程度对其二者进行鉴别。

3.2 HCM中OPN阳性表达的法医学意义

OPN最初由 Oldberg等[10]在小鼠骨组织发现。OPN属于分泌型糖基化磷蛋白，在巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞及上皮细胞等多种细胞中有表达，参与多种生理病理过程。一方面，Trueblood等[11]通过动物实验发现心肌内OPN含量与心肌Ⅰ型胶原mRNA表达存在相关性。在扩张型心肌病患者心肌中OPN、Ⅰ型和Ⅱ型胶原mRNA也明显升高，OPN mRNA与Ⅰ型胶原及CVF存在明确的相关性，且与左室收缩末期内径及射血分数有关，即表明OPN与胶原存在正相关性[12]。另一方面，肾素-血管紧张素-醛固酮系统中重要效应分子血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）促进OPN的过度表达，加速心肌纤维化[13]。同时，OPN也可作为基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族的底物[14]，在MMP调节胶原沉积及细胞外基质降解程中可能起着重要作用[15]。这些研究均表明OPN在心脏纤维化及心脏重塑中起着非常关键的作用。本研究选择OPN作为标志物，观察OPN在3组左心室心肌细胞中的表达变化，结果显示，OPN在3组心肌细胞中均有表达，HCM组和冠心病组左心室心肌组织OPN阳性表达明显高于对照组，说明当发生心肌纤维化时，心肌细胞中OPN被异常激活和表达，参与心肌肥厚的病理发展过程，提示该指标在心肌肥厚的诊断中存在一定的法医学价值。同时发现，HCM组OPN阳性表达也明显高于冠心病组，差异具有统计学意义。因此，我们猜测OPN在表达量上的差异性，可能是由于HCM与冠心病发病机制不同，所致心肌纤维化的病理途径也不同。有文献报道，冠心病也可被认为是一种慢性炎症性“疾病”[16]，当发生心肌梗死时，坏死的心肌组织可激活多种炎症因子诱导炎性修复，形成陈旧性梗死灶，这种发生心肌坏死的纤维化增生，又被称为“修复性纤维化”[17]。据组织学研究显示，HCM患者心肌细胞肥大，心肌间质纤维化[2]，增生的纤维组织包绕肥大的心肌细胞，排列紊乱（通常涉及心室的20%[18]），这种间质纤维化被称为“反应性纤维化”[17]。从这一角度来看，也提示不同心脏疾病甚至同种心脏疾病中也可能存在不同类型心肌纤维化。因此，OPN的阳性表达对于诊断HCM致SCD具有较好的特异性，为鉴定HCM死因提供微观病理学依据，同时也有可能应用于鉴别HCM与冠心病致心肌肥厚。

随着分子生物学技术的发展，法医工作者对HCM致SCD的鉴定也可通过基因筛查寻找诊断依据。对怀疑HCM死者进行基因测序，不仅有助于法医工作者明确死因、消除纷争，还有可能发现家族型HCM家族中的新病例和无症状携带者，为HCM人群预防SCD给予指导。

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2012-03-22）

（本文编辑：张建华）

Changes of Left Ventricular Myocardial Collagen Fibers and Osteopontin Expression in Hypertrophic Cardiomyopathy

TANG Da-wei1,LIN Guo-sheng2,HUANG Jing-lu1,LIU Chao3,HAO Bo1,YU Yan-geng4,KONG Xiaoping5,QUAN Li1,LIAO Xin-biao4,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,SunYat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Nanhai Branch of Foshan Public Security Bureau,Foshan 528000,China;3.Institute of Criminal Science and Technology,Guangzhou Public Security Bureau,Guangzhou 510030,China;4.Center of Criminal Science and Technology,Guangdong Public Security Bureau,Guangzhou 510050,China;5.Panyu Branch of Guangzhou Public Security Bureau,Guangzhou 511400,China）

Objective To investigate the changes of collagen fibers and the expression of osteopontin in the left ventricle in cases of hypertrophic cardiomyopathy（HCM）,along with the significance of their potential forensic application.Methods Fifteen cases of HCM,15 cases of coronary heart disease with cardiac hypertrophy and 20 cases of traffic accidents were selected as HCM group,coronary heart disease group and control group,respectively.Collagen volume fraction and osteopontin expression were observed and compared by HE staining,Masson trichrome staining and immunohistochemistry methods.Imaging and statistical methods were used for quantitative analysis.Results Collagen volume fraction in left ventricle of HCM and coronary heart disease were significantly higher than that in the control group（Plt;0.05）,which was not significantly different between the HCM group and the coronary heart disease group.The integral light density value of osteopontin in left ventricular cardiomyocytes of the HCM group and the coronary heart disease group were significantly higher than that of the control group（Plt;0.05）,and the value of the HCM group was also significantly higher than that of coronary heart disease group（Plt;0.05）.Conclusion The increased contents of collagen fibers and the overexpression of osteopontin may play an important role in myocardial fibrosis,and they can be used as markers in aid of diagnosing sudden death due to HCM.

forensic pathology;cardiomyopathy,hypertrophic;fibrosis;osteopontin

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.002

1004-5619（2012）04-0247-05

国家自然科学基金资助项目（39700167）；公安部科技基础专项资助项目（2011GABJc009）；广东省科技计划项目（2010B031000006）

汤大为（1986—），女，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：41493256@qq.com

罗斌，男，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医病理学（猝死疾病）研究；E-mail：luobin@mail.sysu.edu.cn