兴奋剂生长激素检测方法研究进展

周鑫淼 谢敏豪

1 北京体育大学（北京 100084） 2 国家体育总局反兴奋剂中心

人生长激素是人体自身分泌的重要的肽类激素。重组人生长激素不仅应用于临床医疗，也被滥用于体育运动中，以提高运动成绩。生长激素的检测方法一直是世界各国反兴奋剂工作的研究热点。

1 生长激素概况

人生长激素（hGH）是由脑垂体基底前叶嗜酸性细胞分泌的肽类激素，在人体内发挥着重要而多样的生物学作用[1]。其主要作用为促进人体生长，也参与蛋白质、脂类及碳水化合物的代谢。其分泌方式呈脉冲式，分泌呈明显的昼夜节律性变化，主要受生长激素释放激素[2]或生长抑素[3]等激素的调控。

随着蛋白重组技术的发展[4]，重组人生长激素（rhGH）取代了从尸体脑垂体分离hGH的方式，逐渐被应用于临床治疗。目前，rhGH主要被用于治疗幼儿及成人的生长激素缺乏症，同时也被应用于幼儿特纳氏综合征的治疗、慢阻肺以及烧伤等严重创伤的治疗中。近些年来，由于hGH具有蛋白同化、调节体成分的作用，rhGH已经开始扮演“非治疗用药”的角色，用于抗衰老[1]。

2 hGH的分子生物学基础及其亚型

2.1 hGH基因簇

hGH是由脑垂体分泌的最重要肽类激素，其基因簇位于人第17对染色体长臂，长46.83kb，包含5个与hGH相关的基因[5]，分别为GH-N，GH-V，CS-A，CS-B和CS-L。其中GH-N和GH-V为编码hGH的基因；CS-A和CS-B编码绒毛膜生长催乳素，CS-L表达量很低，没有有效翻译。基因簇中5个基因都是由5个外显子和4个内含子构成的。GH-N在垂体表达，产生人体内正常的hGH；GH-V、CS-A、CS-B在胎盘中表达，并且随着孕期的增加表达量持续升高[6]。

2.2 hGH的亚型

2.2.1 22kD-hGH

hGH在人体内有很多种类，其中最主要的，也是含量最高的是22kD-hGH，它是由GH-N转录后去掉26个氨基酸的信号肽得到的191个氨基酸的肽类激素，约占垂体hGH的70%～75%，占血液循环hGH的43%[6]；是一条单链非糖化的亲水性球蛋白，相对分子量为22124d；包含了四个半胱氨酸（cys）残基，这四个cys残基在分子内分别形成两对二硫键（cys53-cys165,cys182-cys189），使分子具有一大一小两个环。22 kD hGH的三级结构包含4个反向平行的 螺旋，螺旋之间由易于延伸的片段连接[7，8]。

22kD-hGH作为hGH主要亚型，与受体结合，起促人体生长、合成及脂肪代谢的作用。

2.2.2 20kD-hGH

hGH在人体内含量排在第二位的是20kD-hGH,它是由GH-N转录后mRNA选择性剪接得到的，亦由人垂体分泌，其含量较22kD-hGH少，占血液循环中hGH的5%～10%。这种含有176个氨基酸残基的单一肽链容易形成二聚体，包括同型二聚体和与22kD-hGH形成的异型二聚体。20kD-hGH较22kD-hGH少了N端第32～46位的15个氨基酸残基，但是它仍然保持了原有的两对二硫键，这样使得20kD-hGH可以正常折叠并具有和22kD-hGH相似的分子结构以及功能。但是由于与22kD-hGH相比，缺少了第1螺旋的C端以及第1螺旋与第2螺旋之间的环状结构，因此影响20kD-hGH与受体的结合能力[6]。

Hayakawa 等指出，20kD-hGH的促合成作用和22kD-hGH相当[9]；此外，20kD-hGH具有促进脂肪降解、促进IGF-I生成以及调节免疫等功能。

2.2.3 5kD-hGH和17kD-hGH

相对分子量为5 kD和17 kD的hGH是由22 kD-hGH经蛋白酶切割后得到的两个片断。5kD-hGH是22kD-hGH的氨基末端多肽，由N端1～43个氨基酸残基组成；17kD-hGH则由第44～191位共148个氨基酸残基组成。通过各种免疫方法检测证实，二者在人垂体和血液中均有分布。

对啮齿类动物及狗进行的试验显示，5kD和17kD hGH具有调节体内糖代谢平衡的生理功能，在肥胖型小鼠模型或者垂体切除的小鼠中可以检测到5 kD hGH有类似胰岛素样活性[10]；而17 kD hGH则可致肥胖黄鼠糖耐量异常，两者均无促进生长作用。

目前关于17kD的表述，说法不一。有的研究人员认为，17kD-hGH在血液循环中有很高的浓度[11,12]，并且通过水解实验证明了体内17kD的存在；同时，也有研究人员认为，体内并不存在17kD-hGH，而是由于蛋白酶水解22kD-hGH而产生的片段而已。

3 生长激素滥用情况及检测方法现状

3.1 生长激素的滥用情况

由于hGH具有促进蛋白合成作用，此外在预防和恢复骨折中也有潜在的作用，自20世纪80年代至今，rhGH一直被怀疑用于体育运动的不正当竞争。国际奥委会（IOC）于1992年将其列入禁用清单[13]，世界反兴奋剂机构（WADA）也在1999年将其列入禁用清单[14]。

2010年2月，英国反兴奋剂机构查出了世界上第1例违规使用rhGH的检测阳性，使用者是一名橄榄球运动员[15]，截止2011年9月，世界上共有3例生长激素检测阳性，其中含用药豁免1例[16]。2000年以来，多次报道与运动员携带生长激素等有关的案例。例如:在2000年悉尼奥运会期间，一名田径教练曾试图携带rhGH进入澳大利亚[5]；在2002年环法自行车比赛结束后，曾在季军运动员妻子的汽车中发现rhGH[5]；在2004年12月越野滑雪世界杯的比赛中，一名运动员在完成兴奋剂检查后将腰包遗落在了兴奋剂检查站，后被发现其腰包内装有rhGH，国际滑雪联合会（FIS）于2005年2月19日决定对相关运动员处以2年禁赛的处罚[17]。

3.2 兴奋剂生长激素的检测

目前，rhGH的检测方法仍是世界反兴奋剂工作的一大难题。内源性22kDhGH与外源性hGH氨基酸序列以及结构缺乏差异性，同时hGH的分泌呈脉冲式，与年龄、运动、性别、睡眠、饮食均有关且代谢速率快，导致无法将临床直接测定hGH浓度的方法用于鉴别兴奋剂生长激素。目前，研究较为透彻、完整的rhGH兴奋剂检测方法分为两大类，分别为rhGH直接检测法和rhGH间接检测法[5]。

3.2.1 rhGH直接检测法

垂体分泌的内源性hGH包括了多种亚型，而商业生产的rhGH仅有22kD-hGH一种形式。虽然人体内由于年龄、性别、睡眠、饮食、运动等多种因素，hGH浓度相差较大，但是各种hGH亚型之间的比例是恒定的。外源性使用rhGH后，由于内分泌系统的负反馈抑制作用，会迅速抑制人体内源性hGH的分泌，从而导致22kD-hGH与非22kD-hGH比例大幅升高。因此，22kD-hGH亚型与非22kD-hGH的比值可作为rhGH使用的检测依据。

研究人员利用免疫学技术，分别得到了22kD-hGH的单克隆抗体以及非22kD-hGH的单克隆抗体[18]。通过ELISA技术，利用单克隆抗体即可分别测定22kD-hGH的浓度和非22kD-hGH的浓度，然后计算比值。在研究中，rhGH使用组的数据与未使用组的数据很好地区分开，并且在两种之间没有交叉重叠出现[19]。

在原有的相同抗体的基础上，96孔时间分辨荧光免疫测定试剂盒（TRFIA）在2004年雅典奥运会以及2006年都灵冬奥会的兴奋剂检测中进行了评估。世界反兴奋剂机构（WADA）制定的《世界反兴奋剂条例》及《实验室国际标准》中要求，确证任何的阳性结果均需要一个独立的试验。对于免疫学试验来说，“独立的试验”意味着要有独立的表面抗原决定簇的抗体。为此，在原有抗体的基础上，又得到了另外一对与原抗体识别位点不同的单克隆抗体，从而形成了对rhGH及垂体分泌hGH（phGH）拥有不同识别位点的两对ELISA化学发光试剂盒recA与pitA以及recB与pitB，利用发光免疫分析技术（ILMA）进行检测。这些以包被管为载体的试剂盒通过一些WADA认可实验室的实验室比对和方法验证，得到了WADA的认可。目前，该试剂盒被德国柏林的一家公司生产，命名为“GNZ-Zssay GmbH”，作为WADA公认的rhGH检测试剂盒，并已在2008年北京奥运会、2010年温哥华冬奥会等重大赛事中及目前的rhGH的赛外检查中使用[5]。

3.2.2 rhGH间接检测法

rhGH直接检测法检测窗口期较短，因此，研究对rhGH产生的生物学效应（产物）的检测方法——间接检测法，具有重要的实用价值。间接检测法与直接检测法相比，增加了rhGH使用后可检出时间。rhGH注射后会导致血液中多种生物指标发生变化，这些指标比hGH更加稳定，在人体内也有更长的半衰期[19]，同时也不会因为运动、禁食等状态显著变化[1]。间接检测法就是在此基础上建立的，通过检测体内其他与hGH相关的生物学指标判定rhGH使用的检测方法。

hGH发挥其蛋白同化等生理作用主要是由IGF-Ⅰ介导完成的。IGF-Ⅰ在血液中与IGF结合蛋白（IGFBPs）结合，完成转运。hGH分泌同时还会影响胶原蛋白及骨代谢，这些作用主要通过从骨组织及软组织中释放入血的蛋白质中反映出来，例如P-Ⅲ-P等。这些由hGH变化受到影响的蛋白中，有的非常稳定，经常维持在基本值上，同时在运动期间也表现出很好的稳定性。但同时，这些物质的代谢物在尿中含量过低或不稳定，不能用于兴奋剂检测。

为了研究rhGH的检测方法，WADA建立了GH2000计划，通过评估血清中不同的生物学指标来检测rhGH的滥用。选取了对使用rhGH敏感但对运动不敏感，且较稳定的生物学指标:IGF-Ⅰ和P-Ⅲ-P，并建立了rhGH使用的判定公式:

男性指标 = –6.586+2.905×ln（P-Ⅲ -P）+2.100× ln （IGF1）–101.737/age

女性指标 = –8.459+2.454×ln（P-Ⅲ -P）+2.195× ln （IGF1）–73.666/age

由于GH2000项目中的受试者均为高加索人种，为了验证其在其他人种间的平行性，WADA建立了GH2004计划，评估印度、中东、非洲及中国人群的数据。试验证明，上述公式在其他人群中与高加索人基本一致。但是在GH2004项目中，发现P-Ⅲ-P指标与伤病有一定的相关性，受伤后P-Ⅲ-P浓度会增加20%，并维持2～3周[25]。

其他研究表明，健康男性急性注射rhGH后，IGF-Ⅰ和IGFBP-3浓度会持续升高至少1天，同时IGFBP-2浓度下降，IGF-Ⅰ/IGFBP-2与IGF-Ⅰ/IGFBP-3的比例可以考虑发展作为运动员rhGH使用的检测指标。

4 直接检测法的进一步优化

目前，直接检测法作为WADA公认的rhGH检测方法已开始使用，但是从检测结果来看，目前世界上仅有3例生长激素实验室检测阳性，其中包含1例申报治疗用药豁免（TUE）。

直接检测法虽然能够明确地鉴别出使用rhGH的样本，但是由于22kD/非22kD比值在注射rhGH后不久就能恢复正常，窗口期非常短，很难对运动员实施有效监控。此外，非22kD-hGH种类繁多，针对所有非22kD-hGH产生的单克隆抗体，其稳定性、特异性以及干扰因素都很难准确评估。间接检测法与直接检测法相比，虽然具有较长的窗口期，能够检测相关指标在停药后较长时间的异常变化，但是间接指标仍有待于世界反兴奋剂机构的认可。显然，直接检测方法的有效性仍有待提高。

目前，针对直接检测法的研究仍在继续和深入，内容涉及建立基础方法、优化下游实验技术以及优化判定依据三方面。

4.1 直接检测法的基础研究

目前直接检测法的检测依据是检测22kD-hGH与非22kD-hGH的比值，而非22kD-hGH包括多种不同亚型的hGH。因此其单克隆抗体的稳定性、特异性以及干扰因素都很复杂，不如单一蛋白质所得到的单抗稳定。目前直接检测法的研究主要是建立以非22kD-hGH中单一亚基为检测指标的检测方法。

针对目前的试剂盒,WADA资助各国实验室开展关于20k-DhGH单克隆抗体的研究，试图考虑将22kD与20kD-hGH浓度的比例作为兴奋剂检测的指标。Wallace等对17名年龄（26.9±1.5）岁、具备有氧训练史的健康男性，进行了随机重复的静止抗阻力训练。训练构成为20分钟不间断蹬功率自行车，达到80%最大摄氧量。研究结果显示，体内hGH所有亚型的浓度均上升，运动结束后达到峰值，在运动过程中，22kD始终是体内hGH的主要形式；运动后非22kD亚型的比例升高，这可能与20kD清除较慢或其他非22kD亚型导致。不同亚型hGH的多样的生物学作用是否会影响运动后的hGH动态平衡，仍然是一个有待讨论的问题[20]。另有研究表明，正常生理状态下以及其他药物作用下，22kD与20kD hGH亚型的比例是恒定不变的，其比例变化与外源性rhGH的使用高度相关[21]。20kD的比例不受年龄、性别、青春期、体重指数（BMI）以及hGH分泌量的影响，相对固定，相同的结论在其他研究人员的研究中也有报道[20]。由此得出，可以将20kD与22kD的比值作为判定外源性使用rhGH的有效指标。

目前，中国反兴奋剂中心检测实验室等5个实验室都分别得到了20kD-hGH的单克隆抗体。其中我国实验室与日本实验室Toshio Tsushima得到的单克隆抗体稳定性好，且与其他亚型hGH的交叉性较低[22]。但目前，各实验室均未制成能提供市售的20kD-hGH检测试剂盒。

4.2 优化下游实验技术的研究

为了使目前的rhGH检测方法以及正在研究中的20kD-hGH/22kD-hGH的检测方法更有效地检测rhGH的滥用情况，检测技术的优化也是检测方法研究的重要部分，其主要目的是建立稳定的材料及数据来源，并提高实验方法的稳定性、可重复性及灵敏性。为了达到这个目的，目前的优化方式主要包括:1、将检测抗体更换为纯化的山羊体内分泌的抗人GH抗体；2、利用生物素-抗生物素蛋白系统（biotin-avidin complex）调整检测条件，从而达到放大信号的作用[23]。

此外，针对hGH直接检测法，目前还有一项正在开展的研究，即以ELISA为工作原理，利用流式细胞技术开展hGH亚型浓度的测定。该技术将抗体固化在聚苯乙烯微光束上并用特定的荧光标记，最后通过流式细胞仪分别筛选不同类别的亚型并测定浓度。该方法将大幅提高检测灵敏度，将检测级别提高至 pg/ml[23]。

4.3 优化判定依据的研究

关于rhGH直接检测法的检测阳性判定依据，WADA也在根据数据的积累逐步调整。2010年，“rhGH检测方法指南”发布前，男子与女子的判定限差别较大，女子的判定限低于男子，具体判定限见表1。2010年6月，“rhGH检测方法指南”发布后，根据近几年的数据，对原有的判定限进行了调整。提高了kit1的判定限，降低了kit2的判定限，同时男女之间的差别缩小。

关于判定依据的研究，我国兴奋剂检测实验室针对中国人群挑选了25名年轻男性开展了rhGH受试研究，受试剂量为0.1IU/kg/d。依据目前的判定限，单次注射rhGH后，检测窗口平均在12至18小时之间，最长的为21小时，最短的检测窗口仅为6小时，低于Bidlingmaier等得出的32小时[18]。根据WADA实验室技术文件TD2010DL，我国兴奋剂检测实验室依据自2008年以来近3年的实验数据，推算出了更适于中国人群的判定限应在1.5左右。与受试项目的检测数据比对，该数据能够延长检测窗口[24]。

表1 rhGH判定依据比对

5 展望

作为目前WADA唯一认可使用的rhGH检测方法，虽然hGH直接检测法的窗口期很短，但是作为事先无通知的赛外检查，直接检测法仍然是一种有效的rhGH滥用的检测方法，其稳定性高，不会受到运动、年龄、饮食等身体状态的影响。22kD-hGH与20kD-hGH的比例测定将因其亚型的单一性及稳定性，成为直接检测法的发展趋势。

同时，在发展直接检测法的同时，针对检测窗口短的缺陷，生长激素检测方法的研究还应致力于稳定性高且检测窗口长的检测方法。例如:间接指标检测法、白细胞基因表达等。

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