17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

覃斐章，简 洁，焦 杨，黄仁彬

(1.广西医科大学 药学院，广西 南宁 530021;2.桂林医学院，广西 桂林 541004)

玉郎伞系豆科植物疏叶崖豆［Millettia pulchra(Dunn)Kurzvar.Laxior(Dunn)Z.Wei］的干燥根，为广西壮族的习用药材，用于治疗高血压、老年性痴呆，跌打损伤和风湿、消化不良、产后及病后虚弱等［1］。本课题组对玉郎伞成分进行了分离鉴定，从中筛选出一个具有较强抗氧化活性的新化合物［2］——17-甲 氧 基-7-羟 基-苯 并 呋 喃 查 尔 酮(YLSC)，已获国家发明专利(200710034771.2)。我们初步的研究证实，YLSC具有较强的抗氧化、耐缺氧和抗凝血能力，对H2O2及缺氧复氧所致的心肌细胞损伤有较强的保护作用［3］，提示YLSC在抗心肌缺血方面有一定的潜力。为进一步了解YLSC的药理作用，本实验观察了YLSC对缺血再灌注(I/R)大鼠的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料

YLSC(HPLC面积归一法检测纯度为98%)，由广西医科大学药理教研室提供;氯化三苯四氮唑(TTC)，Solarbio公司。

蛋白质、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;细胞凋亡原位检测试剂盒，Roche公司;兔葡萄糖调节蛋白78(GRP78)多克隆抗体、兔caspase12多克隆抗体、鼠β-actin单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology;IgG-HRP、Immobilon-P试剂盒，Pierce公司。

动物呼吸机器，上海奥尔科特生物科技有限公司;722s可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产;Western电泳仪，美国Bio-Rad公司。

SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重250～280 g，广西医科大学实验动物中心提供，试验动物生产许可证:SCXK(桂)2009-0002，试验动物使用许可证:SYXK(桂)2009-0004。

2 方法

2.1 动物分组与给药方法

SD大鼠50只随机分为5组(每组10只):假手术组、模型组、溶媒组、YLSC低剂量组、YLSC高剂量组。假手术组和模型组均给予生理盐水;溶媒组给予含0.5%二甲基亚砜(DMSO)的生理盐水;YLSC低剂量组和YLSC高剂量组分别给予YLSC 2.50 和5.00mg/kg，YLSC 溶液用含0.5%DMSO 的生理盐水配制。各组均按2mL/kg尾静脉注射给药，1次/d，连续给药7d。末次给药后10 min复制大鼠I/R模型。

2.2 大鼠I/R模型的建立

20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠。行气管插管，连接人工动物呼吸机，设置参数为:呼吸频率60～70次/min，潮气量50mL/kg，呼吸比1∶2。四肢皮下插入针灸针，连接肢导联，监测Ⅱ导联心电图。自胸骨左缘第3，4肋间开胸，放入泪囊牵张器撑开两侧肋骨，以便心脏暴露良好。剪破心包膜，左手用眼科捏夹一小棉球，用棉球将胸腺及左心耳轻轻向上推开，于冠状动脉左前降支根部进针穿5-0号缝合线(进针深度约1 mm，宽度约1.5～2 mm)，备结扎用。缺血30 min再灌注60 min建立大鼠I/R模型，以左室前壁紫绀及ST段抬高，QRS幅度升高为结扎成功标志，ST段逐渐降低，左室前壁缺血区紫绀消失为复灌成功标志。假手术组仅穿线不结扎。

2.3 指标检测

2.3.1 血清CK、LDH、AST的测定实验结束后心脏取血3mL，室温静置2 h，4 000 r/min离心10 min，吸取上清液分装，－20℃保存备用。按试剂盒说明书测定血清CK、LDH、AST含量。

2.3.2 心肌梗死面积的测定再灌注结束后尾静脉注射5mg/mL伊文斯蓝1.5mL，30 min后打开胸腔，取出心脏，生理盐水充分洗净残血，滤纸吸干，剪去血管、结缔组织、心房和右心室，留下左心室。将左心室置于－20℃冰箱冷冻30 min，平行房室沟将其切成5～8片，每片厚1～2 mm。切片置于1%TTC中37℃孵育15 min，正常心肌组织染成蓝色，缺血心肌组织染成红色，梗死心肌组织不染色呈白色。将切片展开平铺于载玻片上，数码相机拍照，用病理图像分析软件计算梗死区总面积占缺血区总面积的百分比(infact size/area at risk zone，IS/AAR)。

2.3.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡率 用TUNEL法检测心肌凋亡阳性细胞的分布情况。将每个心脏标本切为5片，每片取5个阳性视野，即每个标本计25个视野。正常细胞核呈蓝色，阳性凋亡细胞核呈棕黄色，平均计算阳性细胞数占总细胞数的百分比作为细胞凋亡率。

2.3.4 Western blot法检测蛋白GRP78、caspase12的表达 抽提组织蛋白，Bradford法计算蛋白含量。取样品100μg，经SDS-PAGE电泳、转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后加入相应稀释倍数的一抗(GRP78、caspase12 的抗体体积比分别为1∶1 000，1∶2 000)，4℃孵育过夜。TTBS洗膜3次后加入相应的二抗工作液(兔抗羊IgG体积比为1∶1 000，马抗鼠IgG体积比为1∶2 000)，室温孵育2 h，Immobilon-P试剂盒显影成像。用Quantity One软件分析蛋白条带的吸光度值，以目的条带的吸光度值/内参β-actin的吸光度值作为蛋白的相对表达量。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 YLSC对大鼠血清CK、LDH、AST含量的影响

由表1可知，与假手术组相比，模型组可以显著升高大鼠血清CK、LDH、AST的含量(P＜0.01);与模型组比较，YLSC可以减少 I/R大鼠心肌 CK、LDH、AST的漏出(P＜0.05或 P＜0.01)，且呈剂量依赖关系。

表1 YLSC对大鼠血清CK、LDH、AST含量的影响(n=10，±s)Tab.1 Effects of YLSC on contents of CK，LDH and AST in serum(n=10，±s)

表1 YLSC对大鼠血清CK、LDH、AST含量的影响(n=10，±s)Tab.1 Effects of YLSC on contents of CK，LDH and AST in serum(n=10，±s)

与假手术组比较:1 P＜0.01;与模型组比较:2 P＜0.05，3 P＜0.01 1 P＜0.01 vs sham group;2 P＜0.05，3 P＜0.01 vs model group

组 别 剂量/(mg/kg) CK/(u/L) LDH/(u/L) AST/(u/L)假手术组 －13.57±1.44 2308.7±270.4 285.6±39.2模型组 － 16.73±1.721 4516.3±572.61 958.6±102.71溶媒组 － 16.54±1.581 4538.9±453.01 1025.8±115.41 YLSC 低剂量组 2.50 14.66±1.552 3724.5±412.81，2 813.0±76.51，2 YLSC 高剂量组 5.00 14.27±1.532 3541.2±380.31，3 754.1±66.81，3

3.2 YLSC对I/R大鼠心肌梗死面积的影响

结果见表2。与模型组比较，YLSC可明显降低I/R 大鼠的IS/AAR(P＜0.01)。

3.3 YLSC对I/R大鼠心肌细胞凋亡率的影响

结果见表2，图1。

阳性凋亡细胞核呈棕黄色，细胞核边集，染色质固缩，细胞体积变小;正常心肌细胞核呈蓝色。假手术组仅见个别散在的凋亡细胞;模型组假手术组比较，凋亡细胞明显增加(P＜0.01);YLSC可以剂量依赖性的减少I/R大鼠的细胞凋亡率(与模型组比较:P＜0.01)。

表2 YLSC对I/R大鼠心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率的影响(n=10，±s)Tab.2 Effects of YLSC on infact size and apoptosis rate in rats with I/R injury(n=10，±s)

表2 YLSC对I/R大鼠心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率的影响(n=10，±s)Tab.2 Effects of YLSC on infact size and apoptosis rate in rats with I/R injury(n=10，±s)

与假手术组比较:1 P＜0.01;与模型组比较:2 P＜0.011 P＜0.01 vs sham group;2 P＜0.01 vs model group

组 别 剂量/(mg/kg)(IS/AAR)/%凋亡率/%假手术组 － 15.4±1.8 1.5±0.2模型组 － 31.0±2.91 40.1±4.31溶媒组 － 30.5±3.21 38.8±2.51 YLSC 低剂量组 2.50 24.1±2.51，2 25.4±1.71，2 YLSC 高剂量组 5.00 20.3±2.41，2 26.3±4.61，2

图1 假手术组(A)、模型组(B)、溶媒组(C)、YLSC低剂量组(D)和YLSC高剂量组(E)大鼠心肌心肌细胞凋亡率变化(TUNEL法，×400)Fig.1 Comparison of apoptosis level in sham group(A)，I/R group(B)，vehicle group(C)，YLSC 2.50mg/kg group(D)and YLSC 5.00mg/kg group(E)(TUNEL，×400)

3.4 YLSC对心肌GRP78和caspase12表达的影响

结果见图2。与假手术组比较，模型组GRP78和caspase12表达明显增加(P＜0.01)，给予 YLSC后，GRP78和caspase12表达量明显减少，且呈剂量依赖性(与模型组比较:P＜0.05或P＜0.01)。

4 讨论

心肌缺氧时，氧自由基生成，能量代谢障碍，使心功能受损。再灌注后活性氧大量生成，炎症介质释放，细胞内钙超载，使细胞膜损伤，完整性丧失，通透性增加，心肌酶漏出。心肌酶释放的多少可以作为心肌损伤的判断标准之一。另有研究认为，心肌梗死范围的大小可以作为评价药物心肌保护作用的金指标［4］。本实验结果显示，应用YLSC后，大量存在于心肌细胞中的CK、LDH、AST的漏出减少，心肌梗死面积减少，表明YLSC可减轻I/R所致的心肌细胞损伤，对缺血心肌具有保护作用。

内质网是分泌蛋白和膜蛋白的重要合成场所［5］。干扰内质网的功能，可使蛋白质发生错误折叠，未折叠蛋白(unfolded protein response，UPR)在腔内聚集，Ca2+平衡紊乱，造成内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。UPR的目的是维持细胞内的平衡，但激烈和持续的ERS能导致细胞凋亡［6］。许多研究发现，I/R介导了ERS。大鼠心肌I/R模型［7］、H9c2细胞［8］、乳鼠心肌细胞［9］等均发现，I/R(或缺氧复氧处理)可导致内质网伴侣蛋白GRP78、caspase12等被特异性的激活，表达增多，活性上调，表明ERS在I/R的发生发展中起着重要的作用。

GRP78是内质网的应激蛋白，属热休克蛋白70家族中的一员，序列高度保守。机体缺氧时，氧化应激导致内质网蛋白折叠能力下降，蛋白合成遭到破坏，最终损伤细胞。GRP78可与内质网中未折叠的或错误折叠的蛋白结合，从而使与GRP78结合的3个UPR的敏感受体IRE1(the inositol-requiring enzyme l)、PERK(the PKR-like ER kinase)、ATF6(the activating transcription factor 6)从GRP78复合物中解离出来，引发UPR，促使机体对ERS作出反应，调节内质网钙稳态失衡的状态。故GRP78被认为是内质网稳态的“中心调节剂”，GRP78表达上调是ERS的标志之一［10］。caspase12在ERS时被特异性的激活［11］，为ERS的标志因子，死亡受体途径和线粒体途径介导的细胞凋亡均不引起caspase12活化。caspase12激活后裂解为caspase3等下游效应蛋白，导致心肌细胞损伤，促发细胞凋亡。本实验发现，I/R诱导的大鼠细胞凋亡率明显增加，GRP78和caspase12表达明显增加，给予YLSC后，上述指标得到不同程度的改善，并呈一定的剂量依赖性。表明YLSC可以减轻 I/R诱导的ERS，减少心肌细胞凋亡。

综上所述，I/R可破坏心肌细胞，导致细胞坏死和凋亡，心肌酶漏出，促使 ERS蛋白GRP78、caspase12表达。YLSC能保护心肌细胞，对抗I/R引起的损伤，其心肌保护作用可能与抑制ERS蛋白GRP78、caspase12的表达有关。

图2 YLSC对心肌蛋白GRP78和caspase12表达的影响(n=10，±s)Fig.2 Effect of YLSC on expression of GRP78 and caspase12 in cardiac myocytes(n=10，±s)

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