重组人肠三叶因子减轻烧伤后肠源性高代谢的实验研究＊

吴修文，王 焕，吴 炜，张 勇，万千雪，金 星，徐淑秀△，彭 曦▲

（1.蚌埠医学院护理系，安徽蚌埠233030；2.第三军医大学西南医院全军烧伤研究所／创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆400038）

肠道不仅是消化器官，还是体内最大的内分泌和免疫器官，肠道神经系统也是仅次于中枢神经系统的复杂体系。因此，“肠道是外科创伤应激的中心器官”这一概念已逐渐为人们接受[1]。但多年来，肠道在严重创伤后机体高代谢反应中的地位仍不够明确。通过多年研究发现严重烧伤后高代谢源不仅来源于创面，肠道也是重要的高代谢源，形成了“肠源性高代谢”的概念[2]。如能有效维护肠黏膜屏障，减少细菌和毒素移位，降低机体过度炎症反应，就有可能预防肠源性高代谢的发生，从而适度降低烧伤后高代谢，改善患者预后。

肠三叶因子（intestinal trefoil factor，ITF）是肠道杯状细胞特异分泌的生长因子类多肽，具有很强的肠道保护功能[3]。本课题组前期研究证实，烧伤后肠道ITF分泌减少，提供外源性ITF能有效减轻烧伤后胃肠道损伤[4]，但是否能进一步降低烧伤后肠源性高代谢还不清楚。因此，本研究将着重观察ITF对烧伤后肠源性高代谢的影响，并探讨其机制，以期为ITF在烧伤临床的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物模型

1.1.1 烧伤模型制作及分组 健康成年BALB／c小鼠72只，体质量（22±3.0）g，雌雄不限（第三军医大学附属大坪医院实验动物中心提供）。随机分成3组，正常对照（control，C）组、烧伤对照（burned，B）组和ITF治疗（ITF）组，实验分烧伤后1、3、5、7 d 4个时相点。C组8只小鼠，B组和ITF组各32只小鼠（每个时相点8只）。C组不予烧伤，其他2组小鼠烧伤前禁食12 h，1%戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔麻醉，背部电推剃毛，称质量后置剃毛区于80℃，水浴20 s，造成30%体表面Ⅲ度烧伤。伤后按40 mL／kg腹腔注入复方乳酸钠液抗休克。创面涂2%碘酊抗感染，每天2次，伤后给予标准动物颗粒饲料喂养，自由饮水。

表1 C组及小鼠烧伤后不同时相点REE的变化（±s，kj×103／m2）

表1 C组及小鼠烧伤后不同时相点REE的变化（±s，kj×103／m2）

＊：P＜0.05，与C组0d时比较；△：P＜0.05，与B组同时相点比较；－：表示无数据。

组别0d 1 d 3 d 5 d 7 d B组－11.24±1.23 18.82±1.42＊22.45±1.96＊28.35±3.12＊ITF组－12.15±1.22 15.88±1.25＊△16.47±1.33＊△19.45±1.78＊△C组12.24±1.15－－－－

表2 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆LPS含量的变化（±s，U／mL）

表2 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆LPS含量的变化（±s，U／mL）

＊：P＜0.05，与C组0d时比较；△：P＜0.05，与B组同时相点比较；－：表示无数据。

组别0d 1 d 3 d 5 d 7 d B组－0.38±0.07＊0.51±0.08＊0.43±0.08＊0.48±0.10＊ITF组－0.24±0.09△0.29±0.11△0.31±0.13＊△0.26±0.12△C组0.15±0.03－－－－

表3 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆TNFα含量的变化（±s，μg／mL）

表3 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆TNFα含量的变化（±s，μg／mL）

＊：P＜0.05，与C组0d时比较；△：P＜0.05，与B组同时相点比较；－：表示无数据。

组别0d 1 d 3 d 5 d 7 d B组－1.63±0.29 4.26±0.52＊3.56±0.48＊4.06±0.30＊ITF组－1.72±0.33 2.50±0.35＊△2.12±0.30＊△2.55±0.25＊△C组1.39±0.21－－－－

表4 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆IL－1含量的变化（±s，ng／mL）

表4 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆IL－1含量的变化（±s，ng／mL）

＊：P＜0.05，与C组0d时比较；△：P＜0.05，与B组同时相点比较；－：表示无数据。

组别0d 1 d 3 d 5 d 7 d B组－0.21±0.06 0.38±0.09＊0.41±0.10＊0.36±0.07＊ITF组－0.23±0.05 0.25±0.06△0.28±0.05＊△0.23±0.04△C组0.19±0.05－－－－

表5 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆IL－1含量的变化（±s，ng／mL）

表5 C组及小鼠烧伤后不同时相点血浆IL－1含量的变化（±s，ng／mL）

＊：P＜0.05，与C组0d比较；△：P＜0.05，与B组同时相点比较；－：表示无数据。

组别0d 1 d 3 d 5 d 7 d B组－0.13±0.02 0.22±0.04＊0.33±0.05＊0.27±0.04＊ITF组－0.12±0.03 0.15±0.03＊△0.18±0.04＊△0.15±0.03△C组0.11±0.03－－－－

1.1.2 药物来源及给药方式 重组人ITF（recombinant human ITF，rhITF）来源于本课题组的前期制备，采用毕赤酵母重组表达发酵获得的rhITF经验证与理论值完全相符，毒理学实验已证实该重组蛋白毒副作用非常轻微。烧伤后2 h后采用rhITF灌胃，剂量为1.0 mg／kg，每次给药容量为0.5 mL，每天分2次给药。

1.2 检测指标

1.2.1 静息能量消耗（resting energy expenditure，REE）测定在清醒、空腹和安静状态下，将小鼠放入一密闭容器中，15 min后收集气体，用血气分析仪测定气体中O2和CO2的变化，再以Weir公式计算：REE（kJ／d）＝[3.9×吸入O2（L／min）＋1.1×呼出CO2（L／min）]×1 440×4.184。小鼠体表面积计算公式：S（cm2）＝KW2／3，K＝0.091 3；W＝动物体质量（g）。

1.2.2 血浆肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor－alpha，TNFα）、白细胞介素－1（interleukin－1，IL－1）和IL－6的检测 采用放射免疫法，试剂盒由北京普尔伟业生物科技有限公司提供，具体操作参见说明书。

1.2.3 血浆内毒素（ipoply saccharide，LPS）测定 采用基质偶氮显色鲎试剂测定其内毒素含量，试剂盒由上海市医研所提供，按说明书操作，单位以U／mL表示。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用多因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

3组小鼠REE、血浆LPS、血浆TNFα、血浆IL－1和血浆IL－6含量变化情况见表1～5。

3 讨 论

生理状况下，肠黏膜屏障能阻止肠腔中绝大部分细菌和毒素的移位，即便偶有移位发生，肠道和肝脏的免疫系统有能力清除移位的细菌和毒素，以维持机体内环境稳定[5]。严重烧伤导致应激反应，组织缺血、缺氧和免疫紊乱，引起肠道组织结构受损，破坏肠黏膜屏障的完整性，导致大量细菌和毒素移位，进而引发全身感染和高代谢反应。实验结果显示，小鼠烧伤后血浆内毒素含量大幅增加，且发生时间早，在伤后第1天即显著高于伤前，烧伤后3 d达到峰值，随后虽有所下降，但仍远高于伤前。给予烧伤小鼠rhITF后能明显降低血浆内毒素含量，提示rhITF能减轻烧伤后肠道损伤，减少肠腔细菌和毒素移位。烧伤后炎症介质TNFα、IL－1和IL－6的变化趋势与内毒素的变化类似，但变化时相晚于内毒素，一般在烧伤后3 d才大幅增加，提示烧伤后肠道内毒素入血是引起其他炎症介质释放的重要因素。烧伤后穿越肠黏膜屏障的内毒素具有很强的免疫刺激活性，能激活多种免疫细胞，产生大量炎症介质，加重组织损伤和参与高代谢反应[6]。实验结果显示，给予rhITF能有效维护肠黏膜屏障，阻止内毒素入血，减轻了对免疫细胞的刺激，避免了炎症反应的级联放大效应，实验结果说明，使用外源性rhITF后能降低肠源性高代谢，使机体代谢率保持在一个较为合理的水平，防止代谢率过高加重机体损伤。

肠源性高代谢是本课题组经过多年研究提出的一个新概念，其定义为：在各种病理状态下，由于肠道本身受损以及肠腔内细菌、毒素移位造成的机体高代谢反应，它是炎症介质、神经递质、激素等多种因素共同作用的结果[2]。肠道损害是引发肠源性高代谢的结构基础，维护肠黏膜屏障功能是降低肠源性高代谢的主要途径。尽管肠源性高代谢的理论已提出，但防治措施还不完善。生长因子，尤其是肠道特异分泌的ITF在保护肠黏膜屏障中的作用值得重视，前期体外研究已经证实，ITF能减轻烧伤血清对肠上皮细胞的损伤，在维护肠黏膜屏障中起重要作用[7]。本实验结果提示，使用外源性ITF能通过减轻烧伤后肠道损伤，维护肠黏膜屏障功能，减少肠腔细菌和毒素移位，减轻炎症介质对免疫系统的刺激，以间接方式降低全身高代谢反应。但ITF是否能直接作用于免疫细胞，调控免疫细胞活性，减轻烧伤后免疫应激，下调机体炎症反应，直接干预机体代谢反应，目前尚不甚清楚，值得深入研究。

[1]Turner JR.Intestinal mucosal barrier function in health and disease[J].Nat Rev Immunol，2009，45（9）：799－809.

[2]汪仕良，邓诗琳.烧伤代谢营养学[M].石家庄：河北科技出版社，2009.

[3]Kjellev S.The trefoil factor family－small peptides with multiple functionalities[J].Cell and Mol Life Sci，2009，66（7）：1350－1369.

[4]Sun Y，Wu W，Zhang Y，et al.ITF produced in escherichia coli promotes the healing of rat burn－induced acute gastric mucosal lesions[J].J Trauma，2008，65（1）：163－169.

[5]Todd WC，Carrie Y，Peterson L，et al.Role of p38 mapk in burn－induced intestinal barrier breakdown[J].J Surgical Res，2009，156（1）：64－69.

[6]Mashkoor AC，Shadab NR，Michael JK，et al.Impaired intestinal immunity and barrier function：a cause for enhanced bacterial translocation in alcohol intoxication and burn injury[J].Alcohol，2004，33（3）：199－208.

[7]吴修文，王焕，万千雪，等.肠三叶因子和黏蛋白对烧伤血清所致肠上皮细胞免疫功能变化的影响[J].中华烧伤杂志，2011，27（5）：341－346.