凝胶渗透色谱-固相萃取-高效液相色谱法测定油脂及油炸食品中的酚类抗氧化剂

申世刚，宋炜，沙润甲，李挥,，张敬轩

(1.河北大学 化学与环境科学学院，教育部药物化学与分子诊断重点实验室，河北 保定 071002；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北 石家庄 050051)

凝胶渗透色谱-固相萃取-高效液相色谱法测定油脂及油炸食品中的酚类抗氧化剂

申世刚1，宋炜1，沙润甲1，李挥1,2，张敬轩2

(1.河北大学 化学与环境科学学院，教育部药物化学与分子诊断重点实验室，河北 保定 071002；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北 石家庄 050051)

建立了使用凝胶渗透色谱-固相萃取-高效液相色谱(GPC-SPE-HPLC)测定油脂及油炸食品中的4种常见酚类抗氧化剂没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)和二丁基羟基甲苯(BHT)的方法.试样经乙酸乙酯-环己烷(V(乙酸乙酯)∶V(环已烷)=1∶1)和乙腈漩涡振荡萃取，凝胶渗透色谱(GPC)和HLB固相萃取柱净化，以乙腈-体积分数为0.1%甲酸水溶液为流动相，以BDS HYPERSIL C18柱作为分离柱，在检测波长280 nm下用紫外检测器检测.方法的检出限为0.6～1.0 mg/kg(油脂样品)和0.3～0.5 mg/kg(油炸样品)，定量限为2～3 mg/kg(油脂样品)和1～1.7 mg/kg(油炸样品)，线性相关系数rgt;0.998，平均回收率为80.3%～94.0%(油脂样品)和80.3%～93.4%(油炸样品)；相对标准偏差(RSD)为3.22%～8.80%(油脂样品)和2.74%～9.62%(油炸样品).该方法选择性好，灵敏度高，检出限低，能够成功地应用于油脂及油炸食品中4种常见酚类抗氧化剂的检测.

凝胶渗透色谱；固相萃取柱；高效液相色谱；酚类抗氧化剂；油脂及油炸食品

油脂及油炸食品中常需要添加抗氧化剂来延长油品氧化反应的诱导期，减缓油品氧化速度，以达到延长油品的使用寿命.最常添加的抗氧化剂有没食子酸丙酯(propyl gallate，PG)、叔丁基对苯二酚(tertiary butyl-hydroquinone，TBHQ)、叔丁基对羟基茴香醚(butylated hyd-roxylanisole，BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated hyd-roxytoluene，BHT)等酚类抗氧化剂，这些抗氧化剂可以单独使用，也可以混合使用.由于长期过量食用含抗氧化剂的食品,对人体健康有不利影响.因此很多国家对食用抗氧化剂都有严格的使用限量[1]，并且有些抗氧化剂在一些国家已禁止使用.

目前，常用于油脂及油炸食品中酚类抗氧化剂的测定方法有液相色谱法[2-7]、气相色谱法[8-9]、气相色谱-质谱法[10-12]、液相色谱-质谱法[13]等.这些方法中，对样品的前处理大多采用液-液提取方式，但是其对脂溶性抗氧化剂的提取效率较低、脂肪基质很难净化完全，选择性不好、灵敏度不高、准确度低，当样品成分比较复杂时，杂质干扰可能严重影响检测结果，从而无法满足含抗氧化剂食品的市场监管和进出口贸易要求.实验采用漩涡振荡萃取，凝胶渗透色谱(GPC)和HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱(HPLC)测定油脂及油炸食品中4种酚类抗氧化剂.本方法选择性好，灵敏度高，自动化水平高.能准确、快速地测定油脂及油炸食品中的4种酚类抗氧化剂.

1 实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；J2凝胶色谱净化系统(美国J2公司)；固相萃取装置(美国Agilent公司)；Oasis HLB固相萃取柱(1 g，6 mL，美国Waters公司)；氮吹仪；KQ-250DV型数控超声波清洗器；PG，TBHQ，BHA，BHT标准品；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、环己烷为色谱纯；其他试剂均为分析纯.

精确称取各抗氧化剂标准品0.100 g，用甲醇溶解定容至100 mL，制得标准储备液(1.00 mg/mL)，置于冰箱中冷藏保存.使用时根据实验要求，再用乙腈稀释成适当浓度的标准品混合工作溶液，冷藏保存.

1.2样品前处理

油脂样品：准确称取1.0 g试样于GPC管中，加入乙酸乙酯-环己烷(V(乙酸乙酯)∶V(环已烷)=1∶1)至10 mL，涡旋振荡提取2 min，过GPC净化，收集7.0～13.5 min的馏分，40 ℃下氮气吹干，残渣中加入乙酸乙酯-环己烷至10 mL，涡旋振荡提取2 min，经过GPC进行二次净化，将馏分在40 ℃下氮气吹干，加体积分数为50%甲醇-水定容至2 mL，过HLB固相萃取柱(事先依次用3 mL甲醇，3 mL水活化柱子)并收集滤液，用4 mL甲醇洗脱，收集约6 mL的洗脱液，40 ℃下氮气吹干，加乙腈定容至1.0 mL, 涡旋混匀，15 000 r/min离心1 min，用0.22 μm滤膜过滤后, 供 HPLC测定.

油炸食品：称取(2.0±0.05)g 粉碎均匀的样品于50 mL 离心管中，加入15 mL 乙腈，旋涡振荡混匀1 min,室温下超声提取15 min.取出离心管，15 000 r/min离心3 min, 将上清液转移至另一50 mL离心管中，用5 mL乙腈重复提取1次，合并2次上清液于40 ℃下氮气吹干，加入乙酸乙酯-环己烷至10 mL，以下步骤同油脂样品的测定.

1.3 GPC条件

GPC条件：CO785凝胶净化柱(美国J2公司)，填料为Boi Beads S-X3(200～400目)；流动相为乙酸乙酯-环己烷；流量4.7 mL/min；进样量5 mL；检测波长254 nm；样品收集时间7.0～13.5 min.

1.4液相色谱条件

色谱柱：BDS HYPERSIL C18色谱柱(100 mm×4.6 mm×2.4 μm)；流动相：A(体积分数为0.1%甲酸水溶液)-B(乙腈)；梯度洗脱：0～2 min, 45%B；2～5 min, 45%～70%B；5～6 min, 70%～95%B；6～18 min, 95%～100%B；后运行时间：5 min；流速：0.3 mL/min；检测波长280 nm；进样量：5 μL；柱温：35 ℃.

2 结果与讨论

2.1样品前处理条件的选择及优化

2.1.1 提取溶剂的选择

分别采用甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯-环己烷(V(乙酸乙酯)∶V(环已烷)=1∶1)作为提取溶剂对同一油炸食品进行提取,对比并考察了不同提取试剂对4种抗氧化剂的回收率.结果表明，乙酸乙酯-环己烷的提取效率最低.乙醇和甲醇的沸点相对较高浓缩费时，且提取的杂质太多,提取效率低，不利于后续GPC和SPE净化，影响最终结果的准确性.采用乙腈作为提取溶剂时,杂质含量相对较低，提取效率高，准确性高，因此选用乙腈作为提取溶剂.比较了不同的萃取时间(10,15,20 min)，萃取体积(5,10,15,20 mL)和萃取次数(1,2,3次)对回收率的影响，结果发现，先用15 mL乙腈超声15 min萃取第1次，后用5 mL乙腈重复萃取第2次，平均回收率可达到90%以上.

2.1.2 GPC和SPE净化条件的选择

相对于单一的液-液萃取方式而言，凝胶渗透色谱不但能有效地去除油脂、天然色素等高分子质量的干扰物，而且可用于小分子物质的分离和鉴定，以及分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物.在流速为4.7 mL/min条件下，向空白油脂基质中添加10 mg/kg的抗氧化剂混合标准溶液，按照1.3条件进行净化，如图1.为了确定4种抗氧化剂在GPC上的收集时间，用1 μg/mL的抗氧化剂混合标准溶液按上述条件进行净化，如图2.从图2可知，4种抗氧化剂的流出时间集中在7.0～11.0 min.考虑到收集的完全性，用5 μg/mL的抗氧化剂混合标准溶液按上述条件进行净化，分别收集6.5～11.0 min，6.5～11.5 min, 7.0～11.0 min, 7.0～11.5 min, 7.0～12.5 min及7.0～13.5 min的馏分进行测定，结果表明，收集时间段为7.0～13.5 min时4种抗氧化剂的回收率均达到90%以上.用10 μg/mL的混合标准溶液按上述条件分别进行GPC一次净化和GPC二次净化，收集7.0～13.5 min的馏分，测定一次净化和二次净化时的回收率，结果表明，一次净化和二次净化时4种抗氧化剂的平均回收率分别为87.6%和92.0%.因此，最终确定收集时间段为7.0～13.5 min，用GPC进行二次净化时4种目标物质的回收率最高.

图1 油脂和抗氧化剂的GPC色谱 图2 抗氧化剂的GPC色谱

为使目标化合物得到进一步的分离和富集，比较了在油脂和油炸食品2种空白基质中分别添加浓度为50 mg/kg和25 mg/kg的混合标准溶液，平行固相萃取3次，比较了3种固相萃取柱(硅胶、C18柱和HLB柱)的净化效果.结果表明，油脂加标的平均回收率分别为82.3%(硅胶)、86.7%(C18柱)和90.3%(HLB柱)，油炸食品加标的平均回收率分别为80.5%(硅胶)、84.4%(C18柱)和91.6%(HLB柱).通过比较不同的洗脱试剂(甲醇、乙腈)、洗脱试剂的体积(3，4，和5 mL)对回收率的影响，最终确定使用HLB柱净化，4 mL的甲醇洗脱时效果最好.

2.2色谱条件的选择

实验优选梯度洗脱，对比了不同流动相的配比，进一步优化柱温、进样量和流速等条件，使4种色谱峰能够完全分开，峰形尖锐，无峰拖尾现象，相应值高，样品测定可在18 min内完成.见图3，图4.

1.PG; 2.TBHQ; 3.BHA ;4.BHT. 1.PG; 2.TBHQ; 3.BHA; 4.BHT.

2.3方法的线性方程和检出限

取4 种酚类抗氧化剂的标准储备液，用乙腈作为稀释液 ，配制成6种不同质量浓度(1,5,10,20,50,100 μg/mL)的混合标准工作溶液，按照2.5色谱条件进行测定，以混合标准溶液的浓度为横坐标(x)、色谱峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线,并采用向空白组织中添加目标化合物的方法, 依据色谱峰信噪比S/N gt; 3 计算方法检出限,S/N gt; 10计算方法定量限(表1).结果显示，4种抗氧化剂在5～100 μg/mL其线性关系良好，相关系数均大于0.998，其检出限(LOD)分别为 0.6～1.0 mg/kg(油脂样品)和0.3～0.5 mg/kg(油炸样品)，定量限(LOQ)为2～3 mg/kg(油脂样品)和1～1.7 mg/kg(油炸样品).

表1 线性方程、检出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.4方法的回收率和精密度

向2种空白基质中分别添加20,40,60 mg/kg(油脂样品)和10,20,30 mg/kg(油炸样品)3个添加水平的混合标准溶液，每种质量浓度平行测定6次(表2).结果表明，上述4种抗氧化剂的平均回收率为80.3%～94.0%(油脂样品)和80.3%～93.4%(油炸样品)，相对标准偏差为3.22%～8.80%(油脂样品)和2.74%～9.62%(油炸样品)，方法定性、定量准确.

2.5实际样品分析

实验测定了不同油脂(花生油、玉米油、大豆油、色拉油)和油炸食品(江米条、方便面、油炸薯片、油炸花生、怪味胡豆)中的4种常见酚类抗氧化剂的含量.结果发现，玉米油和色拉油中含有BHT，含量分别为5.69 mg/kg和7.82 mg/kg，油炸花生和怪味胡豆中均含有TBHQ，含量分别为34.2 mg/kg和27.5 mg/kg，其含量均低于GB 2760-2007制定的食品中抗氧化剂的最高残留限量40 mg/kg(BHT，BHA，TBHQ)和10 mg/kg(PG).

表2 加标油脂和油炸样品的测定

3 结论

建立的GPC-SPE-HPLC法可同时测定油脂及油炸食品中4种酚类抗氧化剂.具有样品检测限低、灵敏度高、选择性好和自动化水平较高等特点，为今后对这4种酚类抗氧化剂的检测提供了一种有效方法，可保证油脂及油炸食品中4种酚类抗氧化剂的定性和定量分析.

[1] AOAC Oficial Method 938.15,Phenolic Antioxidants in Oils, Fats and Butter Oil Liquid Chromatographic Method[S].

[2] KAROVICOVA J, SIMKO P.Determination of synthetic phenolic antioxidants in food by high performance liquid chromatography [J].J Chromatogr A, 2000, 882(1-2): 271-281.

[3] 周建科，宋歌，刘瑞英，等.高效液相色谱法同时测定化妆品中尼泊金酯类防腐剂和特丁基对苯二酚[J].河北大学学报：自然科学版，2010，30(4)：385-388.

ZHOU Jianke,SONG Ge,LIU Ruiying,et al.Determination of TBHQ and nispagin esters in cosmetics using high performance liquid chromatography[J].Journal of Hebei University: Natural Science Edition,2010,30(4):385-388.

[4] 刘年丰，涂一名，夏虹，等.高效液相色谱法测定油脂中抗氧化剂BHA、TBHQ[J].分析科学学报，2003，19(6)：549-551.

LIU Nianfeng, TU Yiming, XIA Hong,et a1.Determination of antioxidants BHA and TBHQ in oil and fat by high performance liquid chromatography[J].Journal Of Analytical Science,2003,19(6):549-55l.

[5] MARCATO B,GUERRA S,VIANELLO M, et al.Migration of antioxidant additives from various polyolefinic plastics into oleaginous vehicles[J].International Journal of Pharmaceutics,2003,257(1/2):217-225.

[6] 周建科，张前莉，韩康，等.油炸食品中两类酚类抗氧剂的反相高效液相色谱法测定[J].食品研究与开发，2006，27(7)：166-168.

ZHOU Jianke, ZHANG Qianli, HAN Kang,et al.Determination of two phenolic antioxidants in fried foods by the reversed-phase HPLC[J].Food Research and Development,2006,27(7):166-168.

[7] FRANCISCO M L D,RESURRECCION A V A.Development of a reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) procedure for the simultaneous determination of phenolic compounds in peanut skin extracts[J].Food Chemistry,2009, 117(2):356-363.

[8] YANG M H, LIN H J, CHOONG Y M.A rapid gas chromatographic method for direct determination of BHA ,BHT and TBHQ in edible oils and fats[J].Food Res Int,2002, 35(7):627-633.

[9] 刘红河，陈卫，康莉，等.气相色谱法同时测定食品中3种抗氧化剂[J].现代预防医学，2006，33(12)：2307-2309.

LIU Honghe, CHEN wei, KANG Li,et al.Simultaneous determination of BHA,BHT and TBHQ in foods by gas chromatography with FID[J].Modem Prevention Medicine,2006，33(12):2307-2309.

[10] ZHANG Weiya, WU Caiying, WANG Chengyun, et al.Determination of antioxidants butylated hydroxyanisole(BHA) and butylated hydroxytoluene(BHT) in cosmetics by gas chromatography-mass spectrometry selected ion method[J].Chinese Journal of Chromatography,2002,20(2):178-18l.

[11] 张伟亚，吴采樱，王成云，等.气相色谱-质谱选择离子法测定化妆品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯[J].色谱.2002.20(2)：178-181.

JEON D H,PARK G Y,KWAK I S, et al.Antioxidants and their migration into food simulants on irradiated LLDPE film[J].LWT Food Science and Technology,2007,40(1): 151-156.

[12] MINUTI L,PELLEGRINO R.Determination of phenolic compounds in wines by novel matrix solid-phase dispersion extraction and gas chromatography/mass spectrometry [J].Journal of Chromatography A,2008,1185(1):23-30.

[13] LEE M, LIN C, LI Z, et al.Simultaneous analysis of antioxidants and preservatives in cosmetics by supercritical fluid extraction combined with liquid Chromatography-mass spectrometry [J].Journal of Chromatography A,2006, 1120(1/2): 244-251.

(责任编辑：梁俊红)

DeterminationofphenolicantioxidantsinoilandfriedfoodsbyGPC-SPE-HPLC

SHENShi-gang1,SONGWei1，SHARun-jia1,LIHui1,2,ZHANGJing-xuan2

(1.College of Chemistry and Environmental Science, Key Laboratory of Medical Chemistry and Molecular Diagnosis, Hebei University, Baoding 071002，China；2.Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050051,China)

A method has been developed for the determination of four phenolic antioxidants, namely propyl gallate(PG),tertiary butylhydroquinone(TBHQ), butylated hydroxyanisole (BHA) and butylated hydroxytoluene (BHT) in oil and fried foods by gel permeation chromatography’solid phase extraction-high performance liquid chromatograph(GPC-SPE-HPLC).The sample was extracted with cyclohexane/ethyl acetate mixture (1∶1,V/V) and acetonitrile on a vortex mixer, cleaned up through gel permeation chromatography and follow a further HLB solid phase extraction, eluted by the mobile phase of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid with BDS HYPERSIL C18 column as the separation column, the eluents were determined by HPLC at wavelength of 280nm using ultraviolet detector.The limits of detection (LOD) was 0.6-1.0 mg/kg(oil) and 0.30-0.50 mg/kg (fried foods), the limits of quantification (LOQ) was 2.0-3.0 mg/kg(oil) and 1.0-1.7 mg/kg (fried foods), the calibration curves showed good linearity with correlation coefficients larger than 0.998,the mean recoveries were in the range of 80.3%-94.0%(oil) and 80.3%-93.4%(fried foods), and accordingly the relative standard deviation ranged from 3.22%-8.80%(oil) and 2.74%-9.62% (fried foods).The method is of high sensitivity, low detection limit, good determination, and can be used to accurately determine four phenolic antioxidants in oil and fried foods.

GPC; SPE; HPLC; phenolic antioxidants; oil and fried foods

O657.7

A

1000-1565(2012)01-0042-05

2011-10-15

河北省平台建设与基础研究重点计划项目(09965120D)

申世刚(1964-),男,河北阜城人，河北大学教授,主要从事食品安全、化学反应动力学方向研究.

E-mail:Shenrq@yahoo.com.cn