LAMP方法快速诊断犬瘟热感染一例

温 海 秦海斌 张汇东 贺星亮

LAMP方法快速诊断犬瘟热感染一例

温 海 秦海斌 张汇东 贺星亮

犬瘟热是由犬瘟热病毒（Distemper virus，CDV）引起的犬科、猫科、鼬科、浣熊科等动物的一种急性、高度接触性传染病，可导致犬50%～100%的发病率和60%～90%病死率，康复犬典型后遗症是犬嗅觉功能下降或丧失。我国1972年首次报道本病在犬流行，并陆续在貉、貂、狐、大小熊猫、猴等动物中发现本病。自20世纪80年代以来，随着我国警、军犬工作的发展及伴侣动物的增多，使人们对本病及病原有了高度的重视。

近几年，众多非典型犬瘟热临床病例的出现使得犬瘟热临床症状越来越复杂，仅根据流行病学、临床症状、包涵体检查和病毒分离等常规方法很难确诊CDV感染，国内外许多学者对CDV诊断进行了大量研究，建立了RTPCR、巢式PCR、套式PCR、原位杂交、原位杂交与RT-PCR结合等多种分子生物学检测方法，这些分子生物学技术从CDV的 RNA入手，通过基因水平来鉴定病毒的存在，具有高度的敏感性、特异性、可信度高等优点，但其反应扩增过程、结果判断环节上均要求具备先进的仪器设备，因而在临床检测中的应用受到限制，因此，让这些技术走出实验室、满足兽医临床应用一直是相关研究的焦点。

2000年，日本Eiken化工有限公司Notomi T等开发了一种新的核酸扩增技术—环介导的等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），在恒温条件（约60℃～65℃）下通过一步反应既能完成靶基因的扩增，若在反应产物中加入一种荧光染料，通过反应产物的颜色变化即可判断是否出现了目的基因的扩增，这些特点使该技术减少了对先进仪器的依赖；同时LAMP技术大大提高了核酸扩增的效率、减少了扩增时间、简化了扩增条件，能够在15min～60min内将DNA扩增109倍～1010倍，成为一种具有临床应用前景的诊断方法。笔者所在实验室利用LAMP技术建立了犬瘟热病毒的快速诊断方法，并将其与普通PCR方法的临床诊断效果进行了对比。现以一例犬非典型犬瘟热感染的诊断为例，说明该方法在犬疫病防控中的有效性和可操作性。

一、发病及临床症状

某犬场一窝德国牧羊犬，5头38日仔犬龄全部发病，未接种疫苗，精神沉郁，鼻镜干燥，其中3头体温高于41℃、另2头39℃，眼睑均有少量分泌物，鼻流清涕，发病1天后出现轻微呕吐、腹泻，3头后期呕吐、腹泻渐重直至死亡。病程中均未呈现出典型犬瘟热的脓鼻、鼻镜干燥、足垫角质化、双相热及神经症状。临床诊断为疑似非典型犬瘟热，选择两头症状较为明显的病犬分别采集眼分泌物、鼻液、血液共6个样本，3头死亡犬采集肺脏进行实验室诊断。纸条、RT-PCR、LAMP对比诊断结果见表1。

表1 不同临床样本三种检测方法的效果比较

二、诊断

以犬瘟热病毒免疫胶体金诊断试纸条、RT-PCR、LAMP技术3种方法对采集的临场样本进行对比检测，比较3种方法的检测效果。结果如下：以进口胶体金试诊断纸条进行现场检测，眼鼻分泌物中犬瘟热诊断结果均为阴性，2个血液样本犬瘟热诊断阳性，肺脏样品未诊断；以进口试剂盒提取RNA，进行CDV病毒的RT-PCR检测，眼鼻分泌物中未检测出CDV病毒基因，血液、肺脏样品CDV病毒基因阳性；以RT-PCR检测中提取的RNA模板，进行LAMP诊断，除2个鼻液样本中未检测出CDV病毒外，其他样本均呈现LAMP阳性结果。胶体金试

对比上述诊断结果可知，3种检测方法均可有效检出犬瘟热病毒的存在，但是基于不同样本中病毒含量的不同，3种检测方法呈现出了不同的敏感性，以LAMP方法的敏感性和检出率最高，RTPCR方法次之，胶体金的灵敏度和检出率最低。证明LAMP方法在临床检测中具备敏感性优势。

另外，与RT-PCR方法比较，LAMP技术的优势在于其结果的可视化，PCR方法只能依靠琼脂糖凝胶电泳进行最后结果的判断，受仪器的局限性大；而LAMP技术除了传统的琼脂糖电泳外（图1），也可通过添加SYBR GreenI、钙黄绿素等染料进行染色，来检测扩增是否发生，在LAMP扩增产物中加入SYBR GreenI，由于SYBR Green I与长度不同茎环DNA结合，阳性产物在自然光下由橙色转变为绿色，不需要借助仪器即可进行结果的判断，见图2。因此，LAMP方法在临床检测中又兼具了操作上的优势。

三、治疗

依据实验室的确诊结果，以单克隆抗体抗病毒治疗为主，辅助结合平衡、消炎疗法。（一）生理盐水250ml/d，1次/d。（二）犬瘟热单克隆抗体2 ml/d，1次/d。（三）头孢拉定250 mg/d，维生素C 200 mg/d，地塞米松0.5 mg/d，连继治疗5d。结果3头犬治疗不愈死亡，2头犬症状逐渐减轻直至痊愈。

四、讨论

早发现、早确诊，对于犬瘟热后期治疗和病情转归极为关键，尤其在近几年非典型犬瘟热发病比例逐渐增多的情况下，诊断技术的灵敏性和操作便捷性对兽医临床极为重要。众多研究表明LAMP技术操作相对简便、扩增效率高、灵敏度高（可达常规PCR的100倍），可进行电泳分析或者加入特定染料观察染色后观察颜色变化来定性检测，这些特点说明LAMP技术作为一种新型的核酸检测技术，可广范应用于犬的病毒、细菌和寄生虫等病原微生物的定性检测。

本文以一例非典型犬瘟热的比较诊断作为范例，展示了LAMP技术在犬瘟热病毒早期诊断中的灵敏性和有效性，为兽医临床诊断提供了一种新方法，但目前而言，LAMP技术的全部操作过程并未完全摆脱仪器设备的束缚，尤其在核酸提取环节仍需要具备一定实验仪器和技术水平，但它在灵敏度、便捷性上的改进，将有望推动和加快核酸扩增技术应用于现场检测的步伐。另外，LAMP技术也存在一定的缺陷，比如引物设计要求较高、存在一定比例的假阳性结果，但这些问题并非不可解决，随着该技术的不断完善和优化，LAMP技术在动物疫病检测领域必将会发挥更大的作用。

（作者单位：公安部南京警犬研究所，210012）

（编辑：李 冰）