覆盆子中山柰酚的TLC鉴别和HPLC测定△

张玲，王德群，查日维，宗镇，张珂

（安徽中医学院药学院现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥 230031）

覆盆子中山柰酚的TLC鉴别和HPLC测定△

张玲，王德群*，查日维，宗镇，张珂

（安徽中医学院药学院现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥 230031）

目的：研究覆盆子药材中山柰酚的TLC鉴别和HPLC测定方法。方法：以硅胶G为固定相，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）为展开剂，1%三氯化铝乙醇液为显色剂，建立覆盆子药材中山柰酚的TLC鉴别方法；以甲醇-0.4%磷酸（55∶45）为流动相，大连依利特色谱柱，流速1 mL·min－1，在360 nm处进行山柰酚的HPLC测定。结果：TLC能检测出山柰酚的特征斑点；山柰酚在HPLC进样0.010 4～0.052μg线性关系良好。结论：该方法简单、可行，可用于覆盆子药材的质量控制。

覆盆子；山柰酚；薄层色谱法；高效液相色谱法

覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingiiHu的干燥未成熟果实，具有益肾固精缩尿，养肝明目的功能，用于治疗遗精滑精，遗尿尿频，阳痿早泄，目暗昏花［1］。现代药理研究表明覆盆子具有温肾助阳、抗诱变、延缓衰老、增强免疫活性、抑菌等药理作用［2-4］。覆盆子的化学成分主要为黄酮、三萜、有机酸和甾醇等［5-7］，其中山柰酚及其苷类为覆盆子黄酮类化合物中最常见的成分之一，具有防癌、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒等多种功效［8］。覆盆子中山柰酚的定性定量分析目前未见报道，本文以山柰酚为指标性成分，建立覆盆子药材中山柰酚的薄层色谱（TLC）鉴别和高效液相色谱（HPLC）测定方法，并对不同采收期覆盆子中的山柰酚进行比较，以期为覆盆子的质量评价提供依据。

1 仪器与试药

LC-10AIVP高效液相色谱仪（日本）；LC solution色谱工作站；HHS型电热恒温水浴锅；HS3120超声波清洗器；CP225D型十万分之一电子天平；WFH-203B三用紫外分析仪。

山柰酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110861-200808）；覆盆子采自安徽青阳，并由安徽中医学院药学院张珂老师鉴定为华东覆盆子Rubus chingiiHu的干燥未成熟果实；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

取覆盆子样品粉末约2 g，精密称定，加70%乙醇75 mL，浸泡30 min，超声45 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL溶解，用石油醚（60～90℃）萃取2次，每次20 mL，弃去石油醚液，水液加稀盐酸20 mL，置水浴中加热1 h，取出，迅速冷却（流水冷却），用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏，干燥，用甲醇溶解，并移至5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取山柰酚对照品，加甲醇制成每1 mL含0.78 mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（2010版 《中国药典》一部附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝-乙醇溶液，吹干，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图1。

2.2 HPLC测定

2.2.1 色谱条件 大连依利特Hypersil ODS-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸（55∶45），流速为 1.0 mL·min－1，检测波长为360 nm；柱温为25℃；进样量：20μL。理论板数按山柰酚峰计算，应不低于3 000。色谱图见图2。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取山柰酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL含山柰酚0.026 mg的溶液，作为对照品贮备液。精密吸取贮备液0.6 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，得对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取覆盆子药材粉末约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，精密加入盐酸5 mL，置90℃水浴中加热水解1 h，取出，迅速冷却，转移至50 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 标准曲线的制备 精密吸取山柰酚对照品贮备液 （0.026 mg·mL－1） 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置10 mL量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液20μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定峰面积，以进样浓度（μg·mL－1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标作图，得山柰酚回归方程为A＝618 009C－780 22（r＝0.999 4）。结果表明，山柰酚在进样 0.010 4～0.052μg线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取同一份对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积积分值，结果山柰酚峰面积平均值为367 954，RSD＝0.72%（n＝6）。表明本方法的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一份样品溶液，分别放置0，2，4，6，8，12 h，按上述色谱条件，分别测定峰面积积分值，结果山柰酚的峰面积平均值为770 694，RSD＝1.79%（n＝6），表明样品在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 分别精密称取同一批覆盆子样品各6份，按上述方法分别测定峰面积积分值，结果山柰酚的平均含量为 0.096 mg·g－1，RSD＝2.57%（n＝5），表明本方法的重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的同一批覆盆子药材粉末6份，每份0.8 g。分别精密加入0.07 mg的山柰酚对照品，按供试品溶液制备项下的方法制备样品溶液，再依法测定山柰酚的含量，结果山柰酚的平均加样回收率为95.26%，RSD＝2.01%（n＝6）。表明本法的准确性较好。

2.2.9 不同采收期覆盆子中山柰酚的含量测定结果按照上述测定方法，测定了安徽青阳不同采收期覆盆子中山柰酚的含量，结果见表1。

表1 不同采收期覆盆子中山柰酚的含量/mg·g－1

从表1可以看出，6月1日采收的覆盆子中山柰酚的含量最高，5月20日采收的含量最低。

3 讨论

研究表明，极大多数黄酮苷类化合物口服后，首先在消化道上皮细胞水解酶或肠道微生物作用下，转变成相应的黄酮苷元而被吸收，口服黄酮苷类化合物的效应成分多为其苷元［9］。鉴于上述原因，本实验建立了覆盆子中酸水解山柰酚的TLC鉴别和HPLC测定方法。

覆盆子的薄层色谱鉴别条件摸索，参考了多种药材的山柰酚TLC展开条件，分别考察了甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）（9∶1∶1）两种不同比例的溶液为展开剂进行展开，结果9∶3∶1效果较好，鉴别斑点清晰、明确。另外进行了固定相聚酰胺和硅胶G的比较，结果硅胶G的斑点位置清晰、易于辨认。所以确定薄层条件为硅胶G薄层板，展开剂甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）。

考察了流动相甲醇-0.4%磷酸（50∶50）、（55∶45）、（60∶40）3种不同比例的流动相对峰形的影响，结果以（55∶45）比例的流动相峰形较好。另外进行了流速的考察，结果1.0 mL·min－1出峰时间、峰形较好。

本实验建立的覆盆子中山柰酚的TLC鉴别和HPLC测定方法，操作简便、快速，准确性和精密度较高。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：359.

［2］程科军.Ⅰ.覆盆子活性成分研究，Ⅱ.金雀根中二苯乙烯类成分的稳定性研究［D］.上海：复旦大学，2008.

［3］苗菊茹，谢一辉，刘红宁.覆盆子的研究进展［J］.江西中医药，2004，35（1）：54-55.

［4］韩加，刘继文.悬钩子属植物生物学作用研究进展［J］.中国野生植物资源，2009，28（2）：1-4.

［5］刘劲松，王刚，王国凯.覆盆子化学成分研究［J］.中国中医药科技，2008，15（3）：197-199.

［6］郭启雷，杨峻山，刘建勋.掌叶覆盆子的化学成分研究［J］.中国药学杂志，2007，42（15）：1141-1143.

［7］游孟涛，李亚葵，郭美丽.覆盆子二氯甲烷萃取物中的化学成分［J］.第二军医大学学报，2009，30（10）：1199-1202.

［8］陈育华，周克元，袁汉尧.山柰酚药效的研究进展［J］.广东医学，2010，31（8）：1064-1066.

［9］吴好好，孙冬黎，钱文春，等.酸水解HPLC测定桑叶中槲皮素及山柰酚含量［J］.中国现代应用药学，2010，27（3）：248-251.

Identification and Determ ination of Kaem pferol in Rubi Fructus by TLC and HPLC

ZHANG Ling，WANG De-qun，ZHA Ri-wei，ZONG Zhen，ZHANG Ke
（Department of Pharmacy，Anhui College of Traditional Chinese Medicine＆Anhui Key Laboratory of Modern Chinese Materia Medica，Hefei230031，China）

Objective：To study the identification method by TLC and the determination method by HPLC of kaempferol in Rubi Fructus.Methods：TLC was used in the identification，silica G was used as the stationary phase，the proportion of methylbenzene-ethyl acetate-methanoic acid（9∶3∶1）was themobile phase.The plateswere sprayed with 1% aluminium choride of ethanol and heated to 105℃for 5 min.HPLC was used in the determination.A C18column was used with amixture of methanol and 0.4% phosphoric acid solution（55∶45）as themobile phase，the rate was 1 mL·min－1with the detection wavelength at 360 nm.Results：The characteristic spot of kaempferol was examined by TLC，themethod was proved to be linear over the range of 0.010 4～0.052μg for kaempferol by HPLC.Conclusion：Themethod is simple and feasible，it provides amethod for the quality control of Rubi Fructus.

Rubi Fructus；Kaempferol；TLC；HPLC

2011-10-07）

安徽省自然科学基金项目（090413101），安徽中医学院自然科学研究基金项目（2011zr0198）

*［通讯作者］王德群，Tel：（0551）5165884，E-mail：ahwdq＠yahoo.com.cn