不同生境及地区哈蟆油药材中氨基酸成分比较分析△

王殿波，陈斌，单舒筠，李峰

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

中药科技

不同生境及地区哈蟆油药材中氨基酸成分比较分析△

王殿波，陈斌，单舒筠，李峰*

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

目的：比较不同生境及地区的哈蟆油药材中氨基酸的含量，为评价该药材质量提供依据。方法：6 mol·L－1盐酸110℃水解24 h，加衍生化试剂2，4-二硝基氟苯，于60℃水浴中衍生1 h，P230II依利特氨基酸自动分析仪测定。结果：同一地区林下产的哈蟆油药材中氨基酸含量，普遍高于稻田产的；相同生境中，林下产哈蟆油药材以吉林产的氨基酸最高；稻田产哈蟆油药材以辽宁产的最高。结论：以哈蟆油药材中氨基酸的含量对其药材质量进行评价，具有一定的实际意义。

哈蟆油；氨基酸；不同生境及地区；含量比较

哈蟆油RANAE OVIDUCTUS为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensisDavid雌蛙的输卵管。性平，味甘、咸；归肺、肾经。具补肾益精，养阴润肺功效。用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血［1］。首载于 《药材资料汇编》［2］。目前哈蟆油商品药材主要为东北地区林下和稻田两种生境中的人工养殖的。本实验收集东北地区两种生境下的26份哈蟆油商品药材，对其中具有补益作用的氨基酸成分的种类与含量进行测定及比较分析，以期为哈蟆油药材质量评价提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

P230II依利特氨基酸自动分析仪；UV230II紫外检测器（大连依利特公司）；AS5150A超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-25型pH计（上海盛磁仪器有限公司）；AR2140电子分析天平（METTLE公司）。

1.2 试药与材料

1.2.1 对照品 ELITE-AAK氨基酸对照品（18种氨基酸）。

1.2.2 试剂 衍生化试剂为2，4-二硝基氟苯（由大连依利特公司提供）。乙腈为色谱纯；冰醋酸，N，N-二甲基酰胺为分析纯；水为纯净水。

1.2.3 材料 哈蟆油商品药材于2010年6月购于各产地，经辽宁中医药大学李峰教授鉴定均为正品，具体生境及产地见表1。

表1 哈蟆油商品药材生境与产地

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS柱，柱温：27℃；检测波长360 nm；流动相总流速1.2 mL·min－1，梯度洗脱，流动相梯度曲线见表2。

表2 流动相梯度洗脱曲线

2.2 流动相的配制

流动相a为乙腈－水（1∶1）；流动相b为流动相固体组分B 4.1 g加水950 mL，用冰醋酸调pH至6.4～6.8，加10mLN，N-二甲基酰胺，置1 000mL量瓶，以水定容，摇匀，备用。

2.3 衍生缓冲溶液的配制

称取衍生缓冲溶液固体组分A 1.24 g，固体组分B 7.063 g，置500 mL量瓶中，以水定容，摇匀，备用。

2.4 平衡缓冲溶液的配制

称取平衡缓冲溶液固体组分A 0.91 g，固体组分B 3.58 g，置250 mL量瓶中，以水定容，摇匀，备用。

2.5 对照品溶液的制备

取ELITE-AAK氨基酸对照品适量，精密称取，用衍生缓冲溶液定容置250 mL容量瓶中，混匀，备用。

2.6 供试品溶液的制备

称取表1中各样品粉末适量（过40目筛，每份约80 mg），精密称定，置具塞试管中，再加入3 mL 6 mol·L－1盐酸，混匀，放入烘箱中110℃水解24 h。将水解后样品从具塞试管转入蒸发皿中，多次用水洗涤，洗液一并转入蒸发皿中，80℃水浴蒸干。以衍生缓冲溶液多次洗涤蒸发皿，洗液转入25 mL容量瓶中，并用衍生缓冲溶液定容，混匀，以0.45μm微孔滤膜过滤。取已过滤的样品液5 mL置25 mL棕色容量瓶中，加衍生化试剂5 mL，混匀，于60℃水浴中，暗处反应1 h，反应完毕，取出冷却至室温，加平衡缓冲溶液定容，混匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

2.7 标准曲线的绘制

分别精密量取2.5项下的对照品溶液5，10，15，20μL，按2.1项下的色谱条件，进样测定，以各氨基酸对照品溶液的进样量为横坐标X，其相应的峰面积值为纵坐标Y，绘制标准曲线，各氨基酸成分的回归方程及线性范围见表3。

表3 各氨基酸的回归方程及线性范围

2.8 方法学考察

2.8.1 精密度试验 取3＃供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样5次测定，各色谱峰的相对保留时间的 RSD≤0.53%、相对峰面积的 RSD≤2.8%，表明仪器精密度良好。

2.8.2 重现性试验 取3＃样品5份粉末适量（过40目筛，每份约80 mg），精密称定，按2.6项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，进样测定，各色谱峰的相对保留时间的RSD≤0.62%、相对峰面积的RSD≤2.9%，表明方法重现性良好。

2.8.3 稳定性试验 取3＃供试品溶液，按2.1项下色谱条件，于2、4、8、10、24 h进样测定，各色谱峰的相对保留时间的RSD≤0.49%、相对峰面积的RSD≤2.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8.4 加样回收率试验 分别取已知含量的3＃样品5份粉末适量（过40目筛，每份约40 mg），精密称定，并分别精密加入2.5项下的对照品溶液，按2.6项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，进样测定，计算加样回收率的RSD≤1.67%。

2.9 含量测定

分别精密量取各供试品溶液10μL，按2.1项下的色谱条件，进样测定，分别测定各供试品溶液的18种氨基酸的色谱峰峰面积，依据标准曲线的回归方程，计算各氨基酸的含量见表4、5。

表4 林下产哈蟆油商品药材中氨基酸种类及含量/%

表5 稻田产哈蟆油商品药材中氨基酸种类及含量/%

3 小结与讨论

由表4、5可见，26份产于东北地区林下与稻田的哈蟆油药材中，均含所检测的18种氨基酸，其中包括8种人体必需氨基酸（与已有文献报道的一致［3-5］）；且各种样品中氨基酸的含量均存在一定差异，因此，检测哈蟆油药材中氨基酸的含量，对于控制哈蟆油商品药材质量具有一定意义。

分别比较表4、表5中，同一生境下不同地区的哈蟆油药材中氨基酸含量进行比较发现，林下产哈蟆油药材中，以吉林的必需氨基酸含量最高，总氨基酸含量以辽宁的最高，两者均以吉林的含量最低；稻田产哈蟆油药材中，必需氨基酸与总氨基酸含量，均以辽宁的含量最高，以黑龙江的含量最低；这可能哈蟆油药材传统主产区及该动物自然分布有关。

将表4与表5数据进行比较，发现同一地区的两种生境所产哈蟆油药材氨基酸含量（氨基酸总量均值及必需氨基酸总量均值）均是林下产的高于稻田产的。这与目前药材市场上认为林下产哈蟆油药材质量较好相一致。

有关哈蟆油药材中氨基酸种类及含量分析已有报道，姜大成等［5］对不同地域产哈蟆油中氨基酸的含量进行了测定，曲婷婷［6］对黑龙江中部地区林蛙油氨基酸含量进行了测定分析。本实验测定哈蟆油药材中氨基酸含量较以上报道中哈蟆油药材中氨基酸含量稍低，这与样品处理方法、测定条件、样品采集时间、样品生境及地区不同有关。

有关氨基酸组分分析方法，有氨基酸自动分析仪分析法［5-8］、高效液相色谱法及毛细管电泳法［9］，本实验采用的是氨基酸自动分析仪分析法。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：239.

［2］江苏新医学院.中药大辞典［M］.下册.上海：上海人民出版社，1977：1651.

［3］王红燕，徐绥绪.哈蟆油化学成分与药理研究概况［J］.中成药，1998，20（9）：39.

［4］李成义，李运春，叶汉光.中国林蛙中氨基酸含量的研究［J］.白求恩医科大学学报，1991，1（4）：351-353.

［5］姜大成，肖井雷.名贵中药哈蟆油质量评价的初步研究［J］.吉林中医药，2010，30（5）：429-431.

［6］曲婷婷.黑龙江省中部地区中国林蛙油营养成分的比较［D］.东北林业大学，2005：16，19-21.

［7］刘继红，尚娟，贾斌，等.蜈蚣、全蝎、地龙氨基酸含量测定［J］.郑州大学学报（医学版），2005，40（3）：483.

［8］李泽鸿，姚玉霞，等.二杠鹿茸与三杈鹿茸中氨基酸含量的比较［J］.氮基酸和生物资源，2003，25（1）：10-11.

［9］贾薇，陈涛，李进.中药中氨基酸含量测定的研究概况［J］.天津药学，2009，21（5）：50-52.

Comparative and Analysis the Composition of Amino Acids in Ranae Oviductus Medicinal Materials in Two Kinds of Habitat and Different Areas

WANG Dian-bo，LIFeng，ZHANG Zhen-qiu
（Liaoning University of traditional Chinese Medicine，Dalian116600）

Objective：Compare the content of amino acids in Ranae Oviductus medicinal materials in two kinds of habitat，provides the basis for evaluating the quality of the medicinal materials.Methods：Hydrolysis in 6 moL·L－1hydrochloric acid in 110℃ for 24 h，add derivative of reagent 2，4-2 nitro fluorine benzene，in 60℃water derivative 1 h，P230IIYiLiTe amino acids automatic analyzer analysis.Results：The content of amino acids in Ranae Oviductus medicinal materials in the same area，in the forests are higher than in the rice fields in common；in the same habitat，in the forest of jilin is the highest，in the rice field of Liaoning is the highest.Conclusion：The contents of amino acid in Ranae Oviductus medicinal materials for quality evaluation is feasible.

Ranae Oviductus；Amino acids；Two kinds of habitat and different areas；Content comparison

2011-10-31）

国家自然基金资助项目（30973881），沈阳市科技局资助项目（1081238-1-00）

*［通讯作者］李峰，E-mail：zhanglijiayi＠163.com