铜绿假单胞菌与水解酶的关系

王 炜，陈晓萌，金 晔

（首都医科大学附属北京友谊医院 检验科，北京100050）

铜绿假单胞菌是假单胞菌属中的代表菌种。最早是在1882年从病人化脓的伤口中分离出来，因产绿色色素，故俗称绿脓杆菌。铜绿假单胞菌是革兰染色阴性细菌，有鞭毛和荚膜，致病菌株有菌毛，一般不形成芽胞，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血症、败血症、伤口感染、泌尿系统感染和囊性纤维化等疾病。

铜绿假单胞菌是医院感染重要的条件致病菌，在医院感染中占有非常重要的地位。在美国，铜绿假单胞菌感染占医院感染的10%，是肺囊性纤维化病人合并肺部感染的首要病原，是导致医院获得性肺炎的第2位病原，约17%的医院获得性肺炎为该细菌导致，同时该菌可引起11%左右的尿路感染，8%的手术部位感染，3%的血液感染［1］。本文探讨水解酶的产生是否铜绿假单胞菌对多种抗生素产生耐药表现的主要机制。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2010年5月－2011年5月，首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心细菌室分离的来自不同患者的铜绿假单胞菌159株。经VITEK2全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）鉴定为铜绿假单胞菌。

质量控制菌株：大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。为我实验室保存菌株。

1.2 受试药物

见表1。

表1 抗菌药物来源、批号和效价

浓度梯度按照CLSI 2010版对敏感、中介、耐药的解释标准自行设计。

1.3 仪器及试剂

培养基：血琼脂平板培养基作为分离培养基（天津金章公司）

Mueller－Hinton（M－H）琼脂为纸片扩散法联合药敏试验用培养基（MH培养基干粉为英国Oxoid公司产品）

药敏板：96孔药敏板购自天津金章公司

生物安全柜（Thermo Scientifc 1300，美国）

电热恒温培养箱（DNP－9162，上海）

比浊仪（生物梅里埃Vitek，法国）

微量移液器（eppendorf，德国）

1.4 方法

1.4.1 抗菌药物敏感性试验 采用微量肉汤稀释法测定以下抗菌药物对试验菌株的最低抑菌浓度MIC，抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟、舒巴坦／头孢哌酮、环丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素、阿米卡星、氨曲南、他唑巴坦／哌拉西林、多粘菌素B。各药物浓度为试验者自行设计、配制。所有MIC数据参照CLSI（Clinical And Laboratory Standards Institute，美国临床实验室标准化委员会）2010版M100－S20文件解释。

1.4.2 三维水解试验检测β－内酰胺酶 ①试剂的配制：克拉维酸溶液2 mmol／L，邻氯西林溶液2 mmol／L，EDTA－Na2溶液（100 mmol／L）。②粗提酶的制备：将新分离的待检菌密涂于1／4 MH琼脂平板（Φ＝90 mm）上，35℃培养24 h后，用灭菌棉棒取下全部菌苔于1 ml灭菌生理盐水中（用1.5 ml离心管）。将离心管置－70℃低温冰箱冻融5次（冻2 h以上，再取出融化），在4℃条件下13 000 r／min离心1 h，抽取上清液，用0.2μm过滤器过滤，取1滴粗提酶液接种于 MH琼脂平板上，35℃培养24 h后，以无菌生长为合格的粗提酶液。③酶型检测：将0.5麦氏单位的标准大肠杆菌ATCC25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，10 min后于平板中央贴一片30μg IPM纸片，距纸片边缘5 mm处垂直打4个1 mm宽10 mm长的槽，分别于槽内加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）、粗提酶液（36μl）＋CLA（4μl）及粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）＋CLA（4μl）把含10μg／片亚胺培南（IPM）贴于 MH平板，分别在距亚胺培南纸片边缘5 mm处，挖2个1×10 mm的槽，分别于槽内加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋EDTA－Na2（4μl），置35℃培养24 h。④酶型判断：当抑菌环出现缺损，形成一指向药敏纸片的矢状菌苔，即酶水解实验呈阴性。加入酶抑制剂时，CLA单独加入时抑酶试验为阳性，即该菌ESBL检测阳性。CLO单独加入时抑酶试验为阳性，即该菌AmpC酶检测阳性。CLO或CLA单独加入不能抑制酶活性（抑酶试验阴性），同时加入CLO和CLA时抑酶试验为阳性，说明该菌同时产生Amp C和ESBLs两种酶。当同时加入CLO和CLA时抑酶试验仍为阴性，该菌可能产生耐抑制剂广谱酶；若EDTA单独加入时抑酶试验阳性，即该菌金属β内酰胺酶（MBL）阳性。见图1。

2 结果

图1 三维水解试验检测β－内酰胺酶阴性

表2 159株碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌对抗菌药物的药敏结果

159株临床分离的非重复铜绿假单胞菌，单药MIC显示试验中铜绿假单胞菌对于CLSI2010推荐和临床常用抗菌药物（碳青霉烯类、头孢菌素类、β－内酰胺类／β－内酰胺酶抑制剂类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类）敏感率低，呈现多重耐药表型，见表2。多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa MRPA）的纳入标准为：抗菌药物耐药种类大于5类（碳青霉烯类、头孢菌素类、β－内酰胺类／β－内酰胺酶抑制剂类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类）；尤其是对于头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦耐药性为100%，对于头孢吡肟、氟喹诺酮类、氨基糖苷类大约半数细菌呈现耐药，对于多粘菌素B细菌全部呈现敏感。推测出现上述现象的原因是临床对于β－内酰胺／β－内酰胺酶抑制剂的使用偏好，经验用药使用此类药物比例较大，容易出现耐药情况。多粘菌素主要作用于细菌细胞膜，使细胞内的重要物质外漏，为慢效杀菌剂。很少通过消化道吸收，主要通过肾脏排出，故肾功能不全者应减少剂量。多粘菌素类不良反应明显，主要为肾毒性和神经毒性，但多粘菌素的抗菌作用强、不易产生耐药性，故当各种革兰阴性杆菌对其他抗菌药物耐药或疗效不佳时，仍可作为选用药物。临床可供选用的是多粘菌素B和多粘菌素E。多粘菌素E在肾、肝、肺等组织中浓度比多粘菌素B高，但不易通过无炎症的血脑屏障［2－4］。

表3 159株铜绿假单胞菌对7类抗生素的耐药情况

水解酶验证：通过三维实验159株Pa中检测出产MBL15株，Amp C酶13株；说明水解酶的产生不是本院多重耐药铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。

3 讨论

铜绿假单胞菌主要是在抗菌药物的选择压力下耐药率不断上升，其耐药机制比较复杂：可通过产生金属β－内酰胺酶水解碳青霉烯类抗菌药物；可通过Opr D2蛋白特异性通道表达减少或缺失减少亚胺培南的进入；通过群体性生物被膜的形成减少抗菌药物的摄入；对已经进入的抗菌药物还可通过主动外排系统泵出。但对不同碳青霉烯耐药机制有所差异，亚胺培南耐药主要涉及外膜蛋白缺失；美罗培南耐药则需细菌主动外排表达增加；金属酶及生物被膜的产生可能导致细菌对所有碳青霉烯类耐药。铜绿假单胞菌的耐药机制极为复杂，这四种机制可单独发挥作用，也可联合发挥作用，但是也有研究证明外排泵在生物被膜耐药中无作用［5－7］，现在还不断有新的耐药机制被发现。本试验只在细菌的表型方面检测了159株铜绿假单胞菌是否产生金属酶或者头孢菌素酶，未进一步检测其它水解酶，下一步实验要进一步完善。对于以上的耐药机制我们还应进行更深入的研究，指导临床合理用药，并积极开发新的抗菌药物来针对这些耐药机制。同时因为这些耐药机制都是在抗菌药物（尤其是第三代头孢菌素）的选择压力下产生或加强的，我们要倡导合理、适量、分阶梯的使用抗菌药物，并对当地重要药物进行周期性耐药监测，提倡个性化选择药物，针对不同的临床药敏试验结果选用不同的抗菌药物，尤其是在治疗过程中耐药性的演变。减缓铜绿假单胞菌耐药的产生和发展，最大限度的减少多重耐药的铜绿假单胞菌出现，从而保障人民群众的生命健康。

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