人巨细胞病毒pp150－pp65蛋白的表达与应用

金玉芬，李艳蕾，华 艳，张晓刚，于 庭＊

（1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.北京英诺特生物技术有限公司，北京100070）

人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，简称HCMV）属疱疹病毒β亚科，是一种DNA病毒，其感染在人群中广泛存在，我国人群中HCMV感染相当严重。HCMV是世界范围内引发先天性感染最常见的一种病毒，在活产儿中感染率为0.2%－2.0%，是风疹病毒感染的2倍［1］。妇女在妊娠初期受HCMV原发感染是引起胎儿宫内感染和发育缺损的重要原因，在孕期原发性感染HCMV的胎儿和新生儿中，80%可导致智力低下、畸形和死亡［2］。HCMV也是器官移植失败和艾滋病病人并发感染死亡的主要原因之一［3］。对非免疫缺陷者常导致长期隐性感染，甚至引起感染细胞的转化、畸变或癌变等［4］。因此快速准确的诊断HCMV病毒感染具有十分重要的意义。

HCMV的结构蛋白包括衣壳蛋白、被膜蛋白以及包膜蛋白。HCMV pp65是HCMV被膜蛋白中最主要的一种，主要是参与病毒基因调节以及改变宿主细胞的代谢，而且在不同的HCMV病毒株中，pp65具有高度的保守性［5］，含有IgM结合表位，对判断急性感染具有很重要的意义。Rolf［6］等的实验表明pp150的495－691aa片段是确诊HCMV既往感染的最适抗原（IgG结合表位），在检测HCMV原发及急性期感染中起着极其重要的作用。

1 实验材料

人巨细胞病毒培养物为中国预防医学科学院病毒研究所惠赠；细菌菌株及载体：pET28a质粒由本实验室保存，E.coli BL21购自北京新经科科技有限公司。酶及其他试剂：DNA polymerase，T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ均为TaKaRa公司产品；蛋白质分子质量标准、Ni－蛋白纯化柱购自北京新经科科技有限公司；试剂盒：抗巨细胞病毒抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）和抗巨细胞病毒抗体IgM检测试剂盒（酶联免疫吸附法）为意大利SORIN公司产品。

2 试验方法

2.1 聚合酶链反应引物

根据目的片段的DNA序列，设计两对引物（P1，P2）和（P3，P4）。P1和P2用于扩增pp150基因片段，P3和P4用于扩增pp65基因片段；引物P1和P4分别带有NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位点，引物P2和P3顺序互补，并共同对应于pp150上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物合成由上海生物工程有限公司完成。引物序列如下：

P1：ATCGCATATGGGCGGCGGTTCGGCCTTCTCG；P2：CGCAGCCACTACCCTTCCCGGGCTGGCC；P3：AAGGGTAGTGGCTGCGCTCTTCTTTTTCGATATCG；P4：ATCGCTCGAGGGGCTGCCATACGCCTTCCAATTCGGC。

2.2 目的基因的克隆

取病毒培养液1μl，加入10×Pfu高保真酶缓冲液5μl，浓度2mmol／L dNTPs 5μl，P1、P2引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加灭菌双蒸水至50 μl。充分混匀。反应条件为变性94℃30s，退火65℃30s，复性72℃60s，进行30个循环，再72℃延伸10min。P3、P4引物克隆方法同上。

再以第一轮PCR扩增得到的pp150片段和pp65片段为模板，加入引物P1和P4，扩增pp150－pp65片段；得到串联的目的基因重组片段pp150－pp65。反应条件为pp150片段和pp65片段分别为1μl，加入10×Pfu高保真酶缓冲液5μl，浓度2 mmol／L dNTPs 5μl，P1、P4引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加灭菌双蒸水至50μl。充分混匀。反应条件为变性94℃30s，退火65℃30s，复性72℃90s，进行30个循环，再72℃延伸10min。

2.3 pET28a－pp150－pp65重组质粒的构建与鉴定

纯化的PCR产物pp150－pp65经NdeI和XhoI酶切，并与经过同样处理的pET28a原核表达载体连接，转化到大肠杆菌TOP10中，抽取质粒DNA，进行酶切鉴定。并转化到大肠杆菌BL21中。

2.4 pET28a－pp150－pp65融合蛋白的诱导表达

将含pET28a－pp150－pp65重组质粒的 BL21菌液以1∶100的比例加入到LB培养液中，37℃振荡培养2小时后加入IPTG至终浓度为1mmol／L，37℃诱导3小时后离心收集菌体，重悬于2×样品缓冲液中，100℃煮沸，进行SDS－PAGE电泳分析。

2.5 表达蛋白的纯化

取诱导后的菌体培养液离心收集菌体，经超声破碎后利用Ni－蛋白纯化柱进行纯化。具体操作按照说明书进行。分别收集洗脱峰蛋白，并进行SDSPAGE凝胶电泳分析。

2.6 重组蛋白的抗原性分析

将重组的菌体蛋白经SDS－PAGE凝胶电泳后，切胶进行蛋白质电转移，将目的蛋白电转至NC膜上，用含质量浓度50g／L脱脂奶的PBS封闭NC膜，4℃过夜，PBS洗膜3次。以封闭液1∶20稀释阳性血清，与NC膜于37℃共同孵育2h后，用PBS洗膜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，37℃孵育1h，PBS洗膜后TMB显色，至目的条带显色清晰时终止反应。

2.7 巨细胞IgG／IgM抗体联合检测试剂盒（胶体金法）的建立

按经典的氯化金－柠檬酸三钠还原法制备胶体金液。用鼠抗人IgM（μ链）单克隆抗体、重组巨细胞病毒抗原和兔抗巨细胞病毒抗体最佳包被浓度包被硝酸纤维素膜，并用方正滴定法确定最佳包被浓度，胶体金标记重组巨细胞病毒（CMV）抗原为示踪物，加入待检血清，观察检测线和质控线位置颜色的变化。

3 结果

3.1 目的基因的克隆和鉴定

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，在1 167bp左右可见特异性扩增条带。将PCR扩增得到的pp150－pp65目的基因纯化后，与相同酶切的质粒pET28a连接，最终连接到表达菌体BL21中。表达质粒经双酶切鉴定，得到1 178bp长度的目的基因片段。与预期大小一致（图1）。

序列测定结果表明插入序列与目的片段完全一致。

3.2 蛋白纯化

将空载体质粒pET28a和重组质粒pET28app150－pp65的菌液进行IPTG 诱导后，经SDSPAGE电泳检测，看到空载体质粒pET28a没有表达蛋白；而含重组质粒 pET28a－pp150－pp65菌经IPTG诱导后，在分子量45kd处出现一条新的蛋白带，其大小与推测的ppET28a－pp150－pp65融合蛋白分子量一致，表达量约占菌体总蛋白的40%左右（见图2）。

3.3 Western blot鉴定

将纯化的目的蛋白进行 Western blot免疫印迹，证实在45kd处有一特异性条带（见图3）。说明表达的pET28a－pp150－pp65蛋白有较好的免疫学活性。

图1 CMV PCR扩增产物（从左至右分别为：蛋白 Marker，pp150－pp65）

图2 pET28a－pp150－pp65表达产物的SDS－PAGE分析

图3 纯化产物的Western blot分析

3.4 巨细胞IgG／IgM抗体联合检测试剂盒（胶体金法）的建立

3.4.1 最佳反应条件的确定 用鼠抗人IgM（μ链）单克隆抗体、重组巨细胞病毒抗原和兔抗巨细胞病毒抗体包被硝酸纤维素膜，包被浓度分别为：2 mg／ml、2mg／ml和5mg／ml，包被量为1.0μl／cm；胶体金标记重组巨细胞病毒（CMV）抗原为示踪物，胶体金标记物喷点量为25μl／cm，最佳反应时间为20分钟。

3.4.2 与进口试剂盒的判定比较 用意大利SORIN的抗巨细胞病毒抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）和抗巨细胞病毒抗体IgM检测试剂盒（酶联免疫吸附法）与本研究研制的巨细胞病毒抗体（IgM／IgG）联合检测试剂盒（胶体金法）对本医院的600份血清分别进行对比。结果如下表1、表2所示。

表1 与意大利SORIN的抗巨细胞病毒抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）进行对比

表2 与意大利SORIN的抗巨细胞病毒抗体IgM检测试剂盒（酶联免疫吸附法）进行对比

根据实验结果得出，本研究研制的巨细胞IgG／IgM抗体联合检测试剂盒（胶体金法）与意大利SORIN的CMV IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫吸附法）的阳性符合率和阴性符合率分别为92.7%和83.1%，总的符合率为90.2%。与意大利SORIN的CMV IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫吸附法）的阳性符合率和阴性符合率分别为88.1%和89.2%，总的符合率为88.5%。

4 讨论

目前巨细胞病毒感染诊断方法有脱落细胞及组织病理检查、病毒分离、分子杂交试验和血清学检查等［7］，但由于前三种方法技术设备要求高，检测周期长的局限性，无法广泛使用，而血清学检查具有简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用。目前大多数检测试剂采用的HCMV蛋白质抗原主要是来源于病毒培养物或是重组表达的单一蛋白片段，由于蛋白质抗原纯度低及特异性差，造成假阳性而降低检测特异性；或者由于单一片段抗原蛋白所含抗原决定簇较少，所识别的抗体相应较少，易造成假阴性而降低检测敏感性。虽然多种单一片段组合制备检测试剂也可以避免上述问题，但必然要求多次进行提取纯化过程，而且小分子蛋白质或多肽的提纯技术要求更高，工作效率太低。

目前国内检测 HCMV－IgM 和 HCMV－IgG主要采用ELISA法，但该法检测所需时间长，操作步骤繁琐、易受类风湿因子等因素的影响，所以结果不稳定。而胶体金法与酶联免疫分析法比较具有便捷、快速、操作简单等多方面的优点。但是目前市场上仅有的一些胶体金法试剂盒都是单独检测HCMV－IgM或HCMV－IgG抗体，尚无同时检测 HCMV－IgM和IgG的产品。

本研究选择pp150的483－682aa，pp65的357－545aa，通过PCR方法连接并制备重组蛋白pp150－pp65，通过 Western blot鉴定该融合表达具有较好的免疫学活性。根据间接法和捕获法原理制备巨细胞病毒IgG／IgM联合抗体检测试剂盒（胶体金法），并分别与意大利SORIN公司的CMV抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）和CMV抗体IgM检测试剂盒（酶联免疫吸附法）进行比较，符合率分别为90.2%和88.5%。研究结果表明pp150－pp65重组蛋白具有高特异性、强免疫原性，而根据该融合蛋白制备的巨细胞病毒IgG／IgM联合抗体检测试剂盒（胶体金法）不仅操作简单，而且针对原发感染或者急性感染不同时期的血清都能检测，不再受感染时间的限制，具有很好的应用价值，完全能满足市场的需要。

［1］牛向兰，侯林浦，谷学英.巨细胞病毒原发感染与非原发感染的鉴别诊断方法［J］.中国生育健康杂志，2008，19（2）：95.

［2］Middeldorp JM.Jongsma J，Haar AT，et al.Detection of immunoglobulin M and G antibodies against cytomegalovirus early and late antigend by enzyme－linked immunosorbent assay［J］.J Clin Microbiol，1984，20（4）：763.

［3］Gaytant MA，Steegers EA，Semmekrot BA，et al.Congenital cytomegalovirus infection：review of the epidemiology and outcome［J］.Obstet Gynecol Surv，2002，57（4）：245.

［4］Huang ES.The pathogenicity of Human Cytomegalovirus.Springer－Vellag［J］.Berin，1993，1.

［5］邱玉红.人巨细胞病毒PP65的基础及应用研究［J］.国外医学妇幼保健分册，2003，14（2）：92.

［6］Rolf V，Vornhagen R，Plachter B，et al.Early serodiagnosis acute human cytomegalovirus infection by enzyme－linked immunosorbent assay using recombinant antigens［J］.J Clin Microbio，1994，32（4）：981.

［7］Lazzarotto T，Guerra B，Lanari M，et al.New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection［J］.J Clin Virol，2008，41（3）：192.