大鼠菌血症模型的建立及其感染时对肝脏功能的影响

李京京，王 丹，吴 刚，赵永峰＊，冯瑞祥

（武警江苏总队南京医院1.影像科；2.检验科，江苏 南京210028）

菌血症是常见的外科感染性并发症，它可引起严重的SIRS和MODS，在临床上具有很高的致死率［1，2］。导致菌血症的原因有很多，例如创伤、术后感染、静脉置管、肠道细菌移位等［3］。如何早期诊断感染的发生，是我们目前临床面临的重要问题。尽管目前临床上有诸多感染检测指标如体温、白细胞计数、C－反应蛋白、细胞因子（TNF－α、IL－6）等，但由于这些检测指标缺乏特异性，在很大程度上影响了对感染早期诊断的准确性。因此，建立一种重复性好、简单可靠的菌血症动物模型，对我们研究细菌感染的发病机制以及筛选感染标志物具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 菌株和动物

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）和大肠杆菌（Escherichia coli）由本室分离，源自大鼠肠道。SD大鼠，由南京军区南京总医院实验动物中心提供，雌性，180－200g。

1.2 主要试剂

麦康凯培养基购自OXOID公司，PCT试剂盒购自R＆D公司。

1.3 细菌培养

将－80℃保存的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌种接种于新鲜配制的LB液体培养基，37℃培养18h。然后离心，用灭菌的PBS洗涤菌体2次，后用无菌的生理盐水重悬菌体，并调整菌液浓度为（2－4）×1010CFU／ml。

1.4 菌血症感染模型的制备

实验分组：SD大鼠64只，雌性，体重180－200 g，将其随机分为3组：生理盐水对照组（16只）；肺炎克雷伯菌感染组（24只），大肠杆菌感染组（24只）。将大鼠适应1周后，开始造模。在感染的第0天，对照组尾静脉注射无菌生理盐水（0.3ml／只），对于感染组，分别尾静脉注射肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌液（0.3ml／只）。注射完成后，分别在感染的第4h、8h、24h、48h、72h、1w 时间点，各处死4只大鼠，无菌收集血液，用于白细胞计数、血浆降钙素原（Procalcitonin，PCT）检测、血液生化以及血培养等分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS12.0统计软件，对实验数据进行统计分析，依不同情况进行 Mann－Whitney U test和单因素方差分析，细菌计数结果以中数（范围）表示，其它实验结果以均数±标准差（）表示。

2 结果

2.1 感染大鼠血液中白细胞的变化 血液中的白细胞（WBC）在感染和炎症反应发生时有数量的变化，在临床上被广泛用来监测感染的发生，本结果显示，在大鼠感染后第4－8h时，白胞数量明显降低，24－72h时开始升至正常水平，而1周又显著上升，呈现先低后高的趋势，见表1。

表1 菌血症大鼠血液中白细胞计数结果

2.2 感染大鼠血液中细菌数量的变化 本研究结果显示，血液中的活菌数量在感染后第4－8h时，活菌数最高，可达到2×103CFU／ml。24－72h时细菌数量有所降低，而1周时，血液细菌培养已为阴性，见表2。

2.3 感染大鼠血浆PCT水平的变化 结果显示，在大鼠感染细菌后4h时，其体内血浆中的PCT开始显著增高（P＜0.01），8h－48h时，一直维持显著增高水平（P＜0.01）。感染后72h时，PCT水平开始降低。一周时，肺炎克雷伯菌感染组其PCT略有显著差异，而大肠杆菌感染组，其PCT水平已降至正常，见表3。

2.4 感染大鼠血浆肝功能酶谱及蛋白的变化 结果显示，在大鼠感染细菌后4h－8h时，其血浆中的ALT、AST开始增高（P＜0.05），而到感染后期时，刚呈现下降趋势。GGT在感染细菌8h时，开始增高，48h－1w时，显著增高（P＜0.01），CHE则显著降低（P＜0.01）。TP和 ALB在感染24h－72h时，一直维持显著降低的水平（P＜0.01），至1w时，恢复至正常水平，见表4，5。

表2 菌血症大鼠血液中细菌培养计数结果

表3 菌血症大鼠血浆PCT水平

表4 大肠杆菌感染大鼠血浆生化指标的变化

表5 肺炎克雷伯菌感染大鼠血浆生化指标的变化

3 讨论

肺炎克雷伯菌和大肠杆菌是临床常见的血培养阳性细菌，它是导致临床菌血症发生的主要菌种［4，5］。在本研究中，我们利用本室分离的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌通过尾静脉感染的方式建立了大鼠的感染模型，研究发现，在大鼠感染两种细菌后，其精神状态、血液生化和微生物等多项指标均发生了显著的变化，其发病过程符合菌血症的病理特征，表明本模型建立可靠，为我们研究菌血症提供了有效的感染模型。

在临床上，血液中的白细胞数量通常被用来反应感染的发生。在本研究中，我们发现，大鼠在感染的急性期（4－8h），血液中的白细胞数量显著降低，只有当大鼠在感染后1周时才显著升高。这可能是由于在感染的急性期，由于大量的细菌进入血液中，机体为了迅速清除入侵的细菌，消耗了白细胞池中贮存的大量白细胞，造成了外周循环血液中白细胞数量的显著降低。当进入感染后期时，机体补充了大量的白细胞，使得血液中的白细胞数量呈现显著增高的趋势。由于大量的研究表明，创伤、炎症、肿瘤等诸多因素均可造成血中白细胞数量的增高，所以白细胞计数对于早期细菌感染预警缺乏较强的特异性。

降钙素原（Procalcitonin，PCT）是近年来新发现的用于诊断全身性感染的标志物，PCT是无激素活性的降钙素（Calcitonin，CT）前肽物质，是由116个氨基酸组成，相对分子量为13kD的糖蛋白。PCT在生理情况下，由甲状腺的C细胞合成分泌。正常人血浆PCT水平很低，其值通常＜0.1ng／ml。而严重感染并有全身表现时，PCT水平明显升高，有时可超过100ng／ml。这时PCT大部分由甲状腺以外的实质器官组织产生［6，7］。在本研究中，我们发现，大鼠在细菌感染后4h时，其血液中PCT的水平即发生显著升高，并且在8h－48h时，一直维持显著增高水平。ROC分析表明，PCT在细菌感染后8－48 h，较之其它标志物（如CRP或白细胞数量等）具有较高特异性和准确性。另外，大量的研究资料表明，PCT在病毒感染或自身免疫性疾病所致炎症反应时，其通常处于较低的水平，因此可以用来区分细菌和病毒所致的感染以及无菌性炎症。但是，在局部存在感染时，PCT水平变化不显著［8，9］。综上，我们认为PCT在细菌感染（尤其是菌血症或败血症）早期诊断方面具有很高的应用价值。

肝脏中的网状内皮细胞（Kupffer细胞，KC），占全身单核吞噬细胞系统的80%－90%，是机体防御细菌感染的一道重要防线。当菌血症发生时，进入血液的细菌途经肝脏，可被kupffer细胞清除。细菌的LPS被KC识别后，激活KC释放大量的化学物质（TNF、白介素B4和补体C5）和毒性介质（血小板活化因子、NO 和内皮素－1），可对肝脏造成损伤［10］。在本研究中，我们发现，在感染发生时，ALT、AST、GGT等水平均显著增高，而TP和ALB则呈现显著降低的趋势。表明肝脏在清除细菌时，产生的炎性介质对其造成了一定的损伤。

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