hAP－2α转录因子酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

黄前川，杨长亮，曹军皓，丁进亚

（广州军区武汉总医院1.检验科；2.耳鼻喉科，湖北 武汉430070）

AP－2（activator protein 2）为一类转录因子家族，包括5个成员，即 AP－2α，β，γ，δ和ε，分子量约为52kDa，参与发育、分化和凋亡等生理过程［1］。已证实过度表达的HER－2是乳腺癌预后不良及药物治疗靶点［2］，HER－2基因启动子上有人 hAP－2α（human activator protein 2alpha，hAP－2α）的结合位点，因而 hAP－2α可以促进 HER－2基因转录［3］，免疫组化实验发现人乳腺癌组织中hAP－2α与HER－2表达明显正相关［4］，可见 hAP－2α高表达是乳腺癌一个重要的分子标志。最近几年的研究发现一些hAP－2α结合蛋白参与hAP－2α介导的乳腺癌病变过程。这些蛋白包括 DEK［5］和 Yin Yang 1［6］等。它们本身不是转录因子，但是可以结合转录因子而增强其转录活性。本实验旨在构建hAP－2α转录因子酵母双杂交诱饵载体，为进一步系统分析hAP－2α及其相互作用蛋白在乳腺癌发生机制中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 酵母双杂交系统的诱饵表达载体质粒pGBKT7、系统阳性对照质粒pGBK7－53，阴性对照质粒pGBKT7－Lam和酵母工程菌株AH109均购自美国Clontech公司；大肠埃希杆菌DH5α为本实验室保存菌株；宫颈癌Hela细胞株由武汉大学基础医学院提供；T4DNA连接酶购自美国Promega公司；限制性内切酶、MulV Reverse Transcriptase均购自加拿大Ferments公司；Trizol试剂购自美国Invit rogen公司；Myc单克隆抗体购自碧云天生物技术研究所；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hAP－2α表达序列的克隆 常规培养和传代宫颈癌Hela细胞株，使用Trizol裂解法提取细胞总mRNA，逆转录合成cDNA；取1μl cDNA为模板，依次在PCR反应体系中加入反应物：10×缓冲液2.5μl、dNTP 0.5μl、hAP－2α引物各（50mmol／L）0.5μl、Taq酶 0.5μl和ddH2O 19.5μl；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，63℃35s，72℃50s，循环30次；72℃10min。引物设计如下：3’－CGGAATTCATGCTTTGGAAATTGACG G－5’，3’－AGTCGACTCACTTTCTGTGCTTCTC CT－5’，分别在两端引入酶切位点SalⅠ和EcoRⅠ；1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测反应产物目的条带。

1.2.2 构建pGBKT7－hAP2α诱饵载体 hAP－2α基因扩增产物和pGBKT7载体用SalⅠ、EcoRⅠ酶切，用 T4DNA 连接酶连接hAP－2α 基因和pGBKT7载体酶切产物，将连接产物转化DH5α感受态细胞后进行培养；挑取阳性克隆，抽提重组质粒，进行测序鉴定及酶切鉴定。

1.2.3 重 组 质 粒 pGBKT7－hAP2α 转 化 酵 母AH109菌株及鉴定 用PEG／LiAc法将诱饵质粒pGBKT7－hAP2α和构建猎物质粒载体pACT2转化入酵母感受态细胞AH109，将转化有重组质粒的感受态细胞涂布于SD－Leu－Trp平板，30℃培养2－3d，将长出的克隆连同阴阳对照一起接种于新的SD－Leu－Trp平板上，30℃维持生长12h，复制至SD－Leu－Trp－His－Ade营养缺陷型平板做自激活活性鉴定。

1.2.4 蛋白质印迹技术分析诱饵质粒pGBKT7－hAP2α蛋白表达 用醋酸锂法将pGBKT7－AP2α转化酵母细胞AH109，在SD－Leu－Trp培养基上进行筛选，挑取2－3mm大小的菌落过夜培养后，提取酵母蛋白质表达产物进行Western免疫印迹分析。由于酵母表达载体pGBKT7的多克隆位点带有人Myc标签，我们所表达的融合蛋白亦带有此标签，所以用抗人Myc单克隆抗体可与之产生免疫反应。同时提取AH109空菌蛋白作为阴性对照。

2 结果

2.1 hAP2α基因的扩增

紫外分光光度计测定总mRNA浓为2.21μg／μl，A260／A280吸光度比值为1.87，说明总 mRNA浓度和纯度均高，反转录为cDNA后成功扩增出目的基因hAP2α，经1%的琼脂糖凝胶电泳可见扩增产物位于1 300bp左右处，与目的基因大小相吻合（图1）。

2.2 pGBKT7－hAP2α诱饵载体构建

将hAP2α基因与载体pGBKT7构建的诱饵载体pGBKT7－hAP2α转化DH5α感受态细胞，摇菌提取质粒，电泳鉴定，可见大小约8 600bp左右的pGBKT7－hAP2α连接产物（图2），并且hAP2α测序正确（结果未显示）；用SalI和EcoRI双酶切后鉴定，可见1 300bp的hAP2α基因和7 300bp左右的pGBKT7（图3），条带大小与预期结果一致，说明诱饵载体pGBKT7－hAP2α构建正确。

图2 pGBKT7－hAP2α连接产物电泳

图1 AP2α扩增产物电泳

图3 重组质粒pGBKT7－AP2α用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定

2.3 诱饵蛋白自激活检测

转化pGBKT7－hAP2α重组质粒的AH109感受态细胞能够在SD－Leu－Trp选择皿上生长（图4－B），不能在SD－Leu－Trp－His－Ade（图4－C）选择皿上生长，而系统阳性对照转化子可在SD－Leu－Trp－His－Ade选择皿上生长（图4C）），证明没有自身激活报告基因的活性，无需3AT抑制。所用的酵母菌株为Clontech系统的AH109，阳性对照PC为pGADT7－T＋ pGBKT7－53，阴 性 对 照 NC 为pGADT7－T＋pGBKT7－Lam。

2.4 蛋白质印迹分析pGBKT7－hAP2α诱饵蛋白的表达

图4 诱饵载体pGBKT7－hAP2α自激活鉴定

提取未转化质粒（对照组）与转化了pGBKT7－hAP2α质粒（实验组）的酵母蛋白质，Western免疫印迹分析结果显示：对照组无表达，而实验组可见明显目的条带且无杂带，该融合蛋白的相对分子质量大小约52KD，条带大小与预期结果相一致，说明该诱饵质粒在AH109酵母细胞中能稳定表达。

图5 pGBKT7－hAP2α在酵母细胞表达的Western blotting结果

3 讨论

hAP转录因子家族与乳腺癌的发生相关，其中hAP－1转录因子在乳腺癌的形成、转移和侵袭中发挥重要作用［7］，而hAP－2α转录因子高表达则促进HER－2癌基因的转录而导致乳腺癌。在前期研究中，我们发现抑制乳腺癌细胞中hAP－2α可引起细胞中HER2－mRNA及其蛋白的表达水平显著下降，同时癌细胞的生长受抑制，提示hAP－2α基因在乳腺癌细胞的发生、发展中具有重要作用［8］，进一步研究则发现乳腺癌细胞中DEK蛋白促进乳腺癌中hAP－2α对 HER2转录作用［4］，DEK 这类自身不是转录因子，却能与hAP－2α形成复合物并增强hAP－2α转录活性的蛋白叫做转录共激活因子［9］，具有协同hAP－2α参与乳腺癌的发生。因此，系统地鉴定hAP－2α结合蛋白并探讨它们在乳腺癌发病中的作用将有利于阐明hAP－2α的致癌机制，这些hAP－2α结合蛋白本身也可以成为潜在的肿瘤标志物和药物治疗的靶点，对于乳腺癌的预防和治疗将具有重要意义。

本实验将hAP2α基因克隆于含有Myc标签的pGBKT7载体中，正确构建诱饵质粒pGBKT7－hAP2α，Myc标签单克隆抗体所检测融合蛋白大小与预期的hAP2α融合蛋白质一致（图5），说明hAP2α蛋白在酵母中表达成功，并且无自激活作用（图4），诱饵载体pGBKT7－hAP2α的构建不仅为下一步应用酵母双杂交技术寻找乳腺癌中未知hAP2α作用蛋白奠定了基础，同时也为寻找新的乳腺癌标志物和治疗靶点提供了研究方法。

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