多指标优选清肝消痤颗粒水提工艺研究

2012-11-01戴薇

亚太传统医药 2012年2期

戴薇

（江苏省中西医结合医院，江苏南京 210028）

清肝消痤颗粒［1，2］系江苏省中西医结合医院临床经验方，由栀子、丹参、甘草等药味组成，具有清肝利湿，化痰散结的功效。该方疗效确切，为了更好地控制产品质量，本实验以方中的栀子苷、丹参素、甘草酸铵的含量为指标，采用多指标评分法优选清肝消痤颗粒的水提工艺，为制定该该制剂的合理提取工艺提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪（Alliance 2695四元泵及自动进样系统，996二极管阵列检测，Empower色谱工作站）；Millipore Milli-Q纯水器；METTLER万分之一及十万分之一电子天平（瑞士）。

1.2 试药

栀子、丹参等药材均购自南京药业股份有限公司中药饮片厂，经南京中医药大学鉴定教研室鉴定均为2010年中国药典一部收载品种。栀子苷、丹参素、甘草酸铵对照品（中国药品生物制品检定所，批号依次为：0749-200007、110855-200203、10731-200205），供含量测定用；重蒸水；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 水提工艺正交［3］试验优选

2.1.1 浸泡条件优选

按处方比例，称取2副药材，加10倍量水浸泡，每隔30min观察一次，结果2h后所有药材基本浸透，吸水量约2倍。因此药材在煎煮之前先浸泡2h。

2.1.2 正交试验设计

根据预试验，对影响水提取工艺的主要因素：加水量、提取时间、提取次数按四因素三水平进行L9（34）正交试验。各因素水平见表1。

表1 水提因素水平

2.1.3 正交试验样品制备

按处方比例称取栀子、丹参、甘草等药材适量，分别按正交试验表设计安排进行试验，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩定容至500mL。

2.1.4 含量测定

选择2017年10月至2018年6月在南京医科大学附属无锡第二医院眼科检查确诊的NAION患者18例（18眼）作为NAION组。其中男8例，女10例。年龄38～78（60.5±10.6）岁，病程3.5～8.0（4.8±1.8）个月。

栀子苷［4-5］的含量测定如下所示：

（1）色谱条件：色谱柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-水（12：88）；流速：1.0mL／min；检测波长：240nm；柱温：30℃。

（2）对照品溶液的制备：精密称取栀子苷适量，加甲醇溶解制成每1mL含369.0μg的栀子苷对照品溶液。

（3）线性范围考察：精密吸取栀子苷对照品溶液0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，求得其回归方程为：Y＝1958169X-168000，r＝0.9999。以上结果表明，在0.185～7.380μg／mL范围内，栀子苷峰面积积分值与进样量有良好的线性关系。

（4）精密度试验：精密吸取对照品溶液（55.35μg·mL-1），连续进样5次，每次20μL，峰面积的RSD 0.1%（n＝5）。

（5）供试品的制备：精密吸取样品液1mL置25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，即得供试品液，注入高效液相色谱仪，见图1，由峰面积计算含量，测定结果见表2。

图1 样品中的栀子苷色谱

丹参素的含量测定如下［6，7］：

（1）色谱条件：色谱柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-0.5%乙酸（3：97）；流速：1.0mL／min；检测波长：279nm；柱温：35℃。

（2）对照品溶液的制备：精密称取丹参素适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.796mg的丹参素对照品溶液。

（3）线性范围考察：精密吸取丹参素对照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，求得其回归方程为：Y＝4.75×105X-7.84×104，r＝0.9999。以上结果表明，在0.796～15.920μg／mL范围内，丹参素峰面积积分值与进样量有良好的线性关系。

（4）精密度试验：精密吸取对照品溶液（0.0998 mg·mL-1），连续进样5次，每次20μL，峰面积的 RSD 0.6%（n＝5）。

（5）供试品的制备：精密吸取样品液2mL置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，即得供试品液，注入高效液相色谱仪，见图1，由峰面积计算含量。测定结果见表2。

甘草酸铵［8，9］的含量测定：

（1）色谱条件：色谱柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-0.5%乙酸（37：63）；流速：1.0 mL／min；检测波长：250nm；柱温：35℃。供试品的高效液相色谱图见图1。

（2）对照品溶液的制备：精密称取甘草酸铵适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.542mg的甘草酸铵对照品溶液。

（3）线性范围考察：精密吸取甘草酸铵对照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，求得其回归方程为：Y＝6.72×105X-2.52×104，r＝0.9999。以上结果表明，在0.542～10.84μg／mL范围内，甘草酸铵峰面积积分值与进样量有良好的线性关系。

（4）精密度试验：精密吸取对照品溶液（84.5 μg·mL-1），连续进样5次，每次20μL，峰面积的RSD 1.0%（n＝5）。

2.2 结果

2.2.1 测定结果

将1～9号实验综合评分进行极差分析，结果见表2。

表2 水提正交试验及结果

2.2.2 方差分析结果

将1～9号实验综合评分进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析结果

2.2.3 正交优选结果

由表2可见，影响水煎煮效果的主要因素中，提取次数（C）对指标成分的影响最大，加水量（A）次之，提取时间（B）影响最小。最优水平组合为A3B3C3，即12倍量水煎煮3次，每次90min。由表3可见，提取次数（C）对指标成分的提取有显著影响，而加水量（A）、提取时间（B）无显著影响。综合表2、表3分析结果，本着节能增效的原则，确定煎煮工艺为：A2B2C3，即加10倍量水煎煮3次，每次60min。