苯酚-硫酸法测定维吾尔药核桃分心木多糖的含量

王 艳，茹仙古丽·哈斯木，韩艳春，阿孜古丽·伊明，阿依吐伦·斯马义＊

（1.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.乌鲁木齐市中医院，新疆 乌鲁木齐 830000）

核桃分心木（diaphragma juglandis fructus，简称分心木），别名胡桃衣、胡桃夹、胡桃隔，是胡桃科核桃属植物核桃的果核内木质隔膜，呈薄片状，多弯曲，体轻质脆，易折断［1］。分心木味苦、涩，性平；归脾、肾经。维吾尔医常用分心木来治疗肾虚遗精等疾病［2-4］。多糖为分心木主要有效成分之一。本研究采用苯酚-硫酸法对分心木提取液中的总多糖进行含量测定，为其质量标准的研究与指标的制定提供实验依据，并为核桃分心木多糖的进一步研究奠定基础。

1 材料、试剂和仪器

1.1 材料和试剂

核桃分心木（diaphragma juglandis fructus）采自新疆和田地区，经新疆医科大学药学院天然药物化学教研室帕丽达·阿布利孜教授鉴定为胡桃科核桃属植物核桃的果核内木质隔膜。无水乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚、95%乙醇、丙酮、乙醚（天津市富宇精细化工有限公司，均为分析纯），浓硫酸、重蒸苯酚（北京北细精细化学品有限责任公司，分析纯），葡萄糖（天津市化学试剂三厂，分析纯）；透析袋（MWCO：500）（上海绿岛科技发展有限公司）等。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外光谱仪（岛津）、EYELA SB-1000型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、AB104-N型多功能电子天平（Toledo Instr.Shanghai Ltd.）、SK2510HP超声清洗仪（上海科导超声清洗仪有限公司）、Edwards Pirani 1001冷冻干燥器（U.K.）、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）等。

2 方法与结果

2.1 核桃分心木粗多糖的制备

核桃分心木粉碎后，过100目筛，得核桃分心木粉末。称取该粉末20.0g，用蒸馏水煎煮3次，分别为2h、2h、1.5h，合并煎煮液并适当浓缩，先后用石油醚、95%乙醇萃取脱脂，余液浓缩至一定体积。采用Sevage法除蛋白，透析袋透析24h，然后将透析液按体积比1∶4加入体积分数为95%的乙醇（使醇终浓度在75%～80%），置于冰箱中醇沉过夜，离心分离，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤1次，置于Edwards Pirani 1001冷冻干燥器中干燥，即得核桃分心木精制多糖。

2.2 核桃分心木多糖样品溶液及葡萄糖标准品溶液的配制

精密称取干燥至恒重的核桃分心木15.8mg，以适量蒸馏水溶解，并定容至100mL，配制成浓度为0.158mg／mL的分心木多糖样品溶液备用。

精密称取干燥至恒重的葡萄糖100mg（105℃），置于100mL的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg／mL的葡萄糖标准品溶液。

2.3 不同浓度苯酚溶液的配制

称取苯酚100g，加铝粉0.1g和碳酸氢钠0.05g，常压蒸馏，收集182℃馏分。分别称取该馏分3、4、5、6、7、8g，置于100mL的容量瓶中，并加新鲜蒸馏水稀释至刻度，摇匀，滤过至棕色瓶中，置冰箱中备用。

2.4 核桃分心木多糖的含量测定

2.4.1 显色及测定条件的选择

（1）最大吸收波长：分别吸取分心木多糖样品溶液2.0mL、葡萄糖标准品溶液0.05mL，置于25mL的比色管中，葡萄糖标准品溶液以蒸馏水补充体积至2.0mL，然后分别加入5%的苯酚溶液1.0mL，摇匀，再滴加浓硫酸5.0mL，迅速振荡摇匀，室温下显色30min，冰水混合物迅速冷却。以2.0mL蒸馏水同上操作作为空白，采用UV-2550型可见-紫外分光光度计进行扫描，扫描波长为400～700nm，扫描结果如图1所示。根据图1，核桃分心木多糖溶液、葡萄糖标准品溶液均在（486±2）nm处有最大吸收峰，且吸收峰峰形相似，因此本实验确定486nm为最大吸收波长。酚溶液1.0mL，摇匀，再依次加入浓硫酸5.0mL，迅速振荡摇匀，分别于室温、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下显色30min，冰水混合物迅速冷却。以2.0mL蒸馏水同上操

图1 核桃分心木多糖溶液、葡萄糖标准品溶液的扫描

（2）显色温度的选择：吸取分心木多糖样品溶液2.0 mL，分别置于不同编号的25mL具塞试管中，加入5%的苯作为空白，在最大波长486nm处，测定各分心木多糖样品溶液的吸光值，结果见图2。由图2可知，分心木多糖溶液在不同温度条件下放置显色，其吸光度值在100℃时最大。故本实验采用100℃作为显色温度。

图2 显色温度对吸光度的影响

（3）显色时间的选择：其他条件不变，按照“2.4.1（1）”和“2.4.2（2）”确定的最大吸收波长及最佳显色温度，只改变显色时间（10、20、30、40、50、60min），分别测定其吸光值，结果见图3。由图3可知，其吸光度值在30min后趋于稳定。因此，显色时间采用30min为宜，各样品溶液应在60min内测定完成。

图3 显色时间对吸光度的影响

（4）浓硫酸用量的选择：其他条件不变，按照“2.4.1（1）”、“2.4.2（2）”及“2.4.3（3）”确定的最佳显色及测定条件，只改变浓硫酸的用量（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0mL），分别测定其吸光值，结果见图4。由图4可知，浓硫酸加入量在5.0mL时水解最完全。

图4 不同硫酸用量对吸光度的影响

（5）苯酚浓度的选择：其他条件不变，按照“2.4.1（1）”、“2.4.2（2）”、“2.4.3（3）”及“2.4.3（4）”确定的最佳显色及测定条件，只改变苯酚溶液的质量分数（3%、4%、5%、6%、7%、8%），分别测定其吸光值，结果见图5。由图5可知，使用3%苯酚时，测得多糖溶液的吸光度值最大，故本实验中采用质量分数为3%的苯酚溶液。

图5 不同苯酚浓度对吸光度的影响

综上所述，确定苯酚-硫酸法测定核桃分心木多糖的最佳条件为：取分心木多糖溶液2.0mL，加入3%的苯酚1.0mL，浓硫酸5.0mL，迅速振荡摇匀，于100℃下显色30min，在波长486nm处测定其吸光值。

2.4.2 标准曲线的制作

分别吸取该葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL，均用蒸馏水补充至2.0mL。按照“2.4.1”确定的最佳显色及测定条件测定各吸光度值，以2.0mL蒸馏水按同样显色操作为空白。以葡萄糖的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖的标准曲线，回归方程为A＝-0.0001+0.0389C，r＝0.9998，样品检测量在5.0～17.5μg／mL范围内与吸光度线性关系良好。

2.4.3 换算因子的确定

精密称取干燥至恒重的分心木多糖1.5mg，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。分别取该样品液6份，每份0.5mL于25mL比色管中，以蒸馏水补充至2.0mL，按照“2.4.1”确定的最佳显色条件测定各吸光值，并根据标准曲线计算出供试液中的葡萄糖含量，按下式计算出换算因子：f＝m／CD。其中，m为称取的分心木多糖质量（mg）；C为多糖液中葡萄糖的质量浓度（mg／mL）；D为多糖的稀释倍数。测得f＝1.71，RSD＝1.07%（n＝6）。

2.4.4 多糖含量的测定

取多糖样品溶液2.0mL，按照“2.4.1”确定的最佳显色条件测定其吸光值，平行测定3次。根据标准曲线计算出多糖液中葡萄糖的质量分数，并按下式计算样品中多糖的质量分数：多糖含量（% ）＝ （C×D×f／W）×100%。式中C为葡萄糖的浓度，D为供试液的稀释因素，f为换算因子，W为核桃分心木的质量。测得核桃分心木中多糖的含量为5.40%（n＝3）。

2.4.5 多糖含量测定方法验证

（1）精密度实验：取分心木多糖样品液各2.0mL，按照“2.4.1”确定的最佳显色条件测定其吸光值，1天内测定6次。考精密度，其RSD（n＝6）为0.1147%。

（2）稳定性实验：取分心木多糖样品液2.0mL，按照“2.4.1”确定的最佳显色条件显色后，测定其吸光值在时间10、20、30、40、50、60min后的变化。其 RSD（n＝6）为0.2813%。

（3）重现性实验：平行取分心木多糖样品溶液2.0mL 6份，按照“2.4.1”确定的最佳显色条件显色，测定其吸光值，其RSD（n＝6）为.0085%。

（4）加样回收率实验：分别取分心木多糖样品溶液（15.8mg／mL）1.0mL，以蒸馏水分别稀释至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，吸取稀释后的多糖溶液各1.0mL，再分别加入0.05mL的标准葡萄糖溶液，然后以蒸馏水补充至2.0mL，按照“2.4.1”确定的最佳显色条件进行显色并测定其吸光值，结果见表2。

表1 加样回收率实验

从“2.4.5”项下各实验结果可以看出，多糖样品溶液在显色后1h内测定结果稳定，测定结果的重现性好（RSD＝1.0%，＜3%），精密度高（RSD＝0.1%，＜5%），回收率较高（平均回收率为106.55%，RSD为5.18%）。

3 结论

实验表明，苯酚-浓硫酸法测定分心木中多糖的含量时，显色反应过程中需加热。因为向分心木多糖溶液中加入浓硫酸的过程虽是放热反应，但不能满足显色反应的需要。

采用苯酚-浓硫酸法进行多糖含量测定时，常使用葡萄糖［5，6］、阿拉伯糖［7］、葡聚糖［8，9］等作为标准品。其中，葡萄糖最为常用。但是天然药物多糖的单糖组成较为复杂，且不同单糖的标准曲线各有差异［6］。因此，本实验采用核桃分心木精制多糖进行各项实验，尤其是以精制多糖计算换算因子，一定程度上避免了用葡萄糖作标准品而引起的系统误差。

多糖含量的测定方法主要有苯酚-浓硫酸法［10，11］、蒽酮-浓硫酸法［12］、咔唑-硫酸法、3，5-二硝基水杨酸（简称DNS）法［13］、Fehling还原滴定法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、薄层扫描法（TLCS）、高效毛细管电泳法（HPCE）［14］等。本研究采用苯酚-浓硫酸比色法测定核桃分心木中多糖的含量，多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在波长486nm处有特征吸收。该方法的结果具有准确可靠、重现性好、简便快速等优点，可作为维吾尔药核桃分心木中多糖含量测定的参考依据。

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