连翘提取物对RAW 264.7细胞生成NO及表达iNOS的影响

王 耀，方 辉，高 万，侯建国，刘圆圆，赵 烽

（烟台大学 药学院，山东 烟台 264005）

连翘，又名旱莲子（《药性论》）、大翘子（《新修本草》），为木犀科植物连翘Forsythia suspensa Thunb.的干燥果实［1］。味苦微寒，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、消肿散结的功效，主治痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋尿闭［2］等。本文研究了连翘乙醇提取物对脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞释放炎性介质（NO、TNF-α）及一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达的影响，以期探讨连翘抗炎的相关机制。

1 材料

连翘（产地陕西）购自烟台生生堂药房有限公司。RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；LPS、MTT购自Sigma公司；0.25%胰酶消化液、小鼠TNF-αELISA试剂盒为烟台赛尔斯生物技术有限公司产品；anti-murine iNOS polyclonal antibody，COX-2（murine）polyclonal antibody购自Cayman公司；β-actin antibody购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

2 方法

2.1 提取

将药材放入1000mL的圆底烧瓶中，加8倍量70%乙醇，接上冷凝管，置于水浴中加热回流提取2h。提取液抽滤，药渣再加入6倍量70%乙醇加热回流提取1h。合并2次提取液，减压浓缩回收乙醇，得提取浸膏，干燥称重。实验前以DMSO溶解配制成所需浓度，-20℃保存备用。

2.2 细胞培养及传代

小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37℃CO2培养箱中常规培养，隔天传代。

2.3 NO浓度测定及细胞生长活性检测

按照文献［3］中所述的方法进行测定。

2.4 ELISA法测定TNF-α浓度

取RAW 264.7细胞，以每毫升含5×105个细胞的密度接种于96孔板（每孔200μL），每组设3个平行孔。培养1h后给药，6h后收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书方法进行测定，根据标准曲线计算TNF-α的浓度。

2.5 Western Blot法检测iNOS、COX-2及内参蛋白βactin表达水平

药物干预24h后，弃去上清液，加入PBS清洗，细胞刮收集细胞，1000r·min-1离心3min，留细胞，继续加入PBS，超声破碎细胞，10000r·min-1离心5min，取上清用Bradford法进行蛋白定量，取等量蛋白行10%SDS-PAGE电泳。转膜后室温封闭1h，分别加入iNOS、COX-2、β-actin一抗溶液，4℃孵育过夜，洗膜；HRP标记的二抗溶液室温孵育1h，加入ECL化学发光液，X光片显影。

3 结果

3.1 连翘提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的抑制作用

空白组中NO浓度仅为2.59μmol·L-1，在1μg·mL-1的LPS刺激下，巨噬细胞释放出大量的 NO（16.42 μmol·L-1），经3～4次重复实验表明两组间有显著性差异（P＜0.01），表明LPS能诱导RAW 264.7细胞释放大量炎性介质NO。与LPS组相比，经连翘提取物作用后，NO的含量明显减少，呈现出良好的剂量依赖关系。结果见表1。

表1 连翘对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的抑制作用

3.2 连翘提取物对RAW 264.7细胞增殖无显著影响

连翘提取物在12.5～100μg·mL-1浓度范围内，对RAW 264.7细胞的正常增殖均无明显抑制作用，高浓度下（100μg·mL-1）作用24h后，给药组细胞的存活率为100.28%，无细胞毒性。

3.3 连翘提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞释放TNF-α水平的影响

如表2所示，空白组中 TNF-α的浓度为73.11 pg·mL-1，经LPS刺激6h后，细胞释放大量的TNF-α，此时TNF-α的浓度为2745.67pg·mL-1，与空白组比较有显著性差异（P＜0.01）。连翘提取物可以明显抑制LPS诱导RAW 264.7细胞释放 TNF-α。

表2 连翘提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞释放TNF-α的抑制作用

3.4 连翘对iNOS、COX-2蛋白水平的影响

Western印迹结果表明，连翘提取物干预后iNOS蛋白水平明显降低，而COX-2蛋白水平无明显改变，见图1。

图1 连翘对iNOS、COX-2蛋白水平的影响

4 讨论

NO是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化以L-精氨酸为底物生成的［4］，在机体的很多生理和病理过程中发挥着重要作用，调节NO的生成及iNOS的表达被认为是治疗某些疾病的重要手段［5］。国内外经常把连翘和其它的中草药配伍，制成复方制剂应用于临床，但其分子作用机理尚不十分清楚。本研究针对连翘提取物对LPS诱导巨噬细胞释放NO、TNF-α等炎症因子的抑制作用进行了研究，结果表明其能显著抑制RAW 264.7细胞分泌NO和TNF-α，并且对iNOS蛋白表达水平也有抑制作用。由此可以明确连翘是通过调控巨噬细胞iNOS通路发挥抗炎作用。

［1］宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典［M］.北京：人民卫生出版社，2001：1041.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005：117.

［3］赵凯华，赵烽，刘珂.腺梗豨莶提取物对脂多糖活化巨噬细胞释放一氧化氮的抑制作用［J］.烟台大学学报：自然科学与工程版，2009，22（2）：137-140.

［4］ZAMBONI DS，RABINOVITCH M.Nitric oxide partially controls Coxiella burnetti PhaseⅡinfection in mouse primary macrophages［J］.Infect Immun，2003，7（1）：1225-1229.

［5］KLEINERT H，PAUTZ A，LINKER K，et al.Regulation of the expression of inducible nitric oxdie synthase［J］.Eur J Pharmacol，2004，500（13）：255-266.