川芎提取工艺的研究

马建春，曾 佳，关石凤，区通源

（广东药学院附属第一医院 药学部，广东 广州 510080）

川芎系伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，味辛、温，具有活血行气、祛风止痛的功效［1］，其主要活性成分为川芎嗪和阿魏酸。研究证实阿魏酸具有抗动脉粥样硬化、抗血小板凝集及抗菌消炎等功效。阿魏酸的提取多采用渗漉法和加热回流法。超临界CO2萃取法（SFE-CO2）具有效率高、操作温度低、无溶剂残留及产品易分离等优点，越来越多地应用于中药脂溶性成分的提取。本文以提取物中阿魏酸的含量为指标，考察了渗漉、加热回流、SFE-CO2等方法川芎中阿魏酸的提取率，优选其工艺条件，为工业化生产提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Dionex ultimate 3000高效液相色谱仪、光电二极管阵列检测器、Chromeleon色谱工作站（美国Dionex公司）；HA121-50-01超临界流体萃取设备（江苏科研仪器有限公司）；BS423S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110773-201012）；川芎药材购自广州致信药业有限公司，经鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，测定阿魏酸含量为0.8%，符合《中国药典》2010版一部川芎项下规定，粉碎成粗粉（过20目筛）备用；川芎提取物（广东药学院附属第一医院自制，批号101225）；甲醇为色谱醇，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品溶液制备

2.1.1 醇提法［2］

取川芎粗颗粒20g，加80%的乙醇8倍量，回流提取两次，每次1.5h，提取液合并，滤过，滤液定容至500mL，作为样品溶液Ⅰ。

2.1.2 超临界CO2萃取法（SFE-CO2）［3］

取川芎粗颗粒300g放入萃取釜中，加入50%药材量（mL·g-1）乙醇为夹带剂，萃取压力40.0MPa，萃取温度50℃，解析压力6MPa，解析温度45℃，动态萃取2h。收集提取物，定容至500mL，作为样品溶液Ⅱ。

2.1.3 渗漉法［4］

取川芎粗颗粒20g，加95%乙醇浸泡48h，渗漉速度为15滴／min，渗漉时间为8h，渗漉液合并，滤过，滤液定容至500mL，作为样品溶液Ⅲ。

2.2 阿魏酸含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取阿魏酸对照品10.56mg，加甲醇溶解并定容至10mL量瓶中；再精密吸1mL，甲醇稀释并定容至50mL，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

精密吸取样品溶液Ⅰ、Ⅲ各1mL，分别置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣分别用甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液Ⅰ、Ⅲ。

精密吸取样品溶液Ⅱ1mL，用甲醇稀释并定容至20mL量瓶中；再精密吸取1mL，甲醇稀释并定容至10mL，摇匀，作为供试品溶液Ⅱ。

2.2.3 色谱条件

色谱柱为 Dikma C18（5μm，250mm×4.6mm）；流动相为甲醇-1%冰醋酸（33：67）；检测波长为323nm；流速为1.0mL·min-1；柱温为30℃；进样量为10μL。在此条件下，供试品阿魏酸与其他峰能达到基线分离，阿魏酸峰保留时间约为16min。

2.2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述对照品溶液3、5、10、15、20、30μL，注入液相色谱仪，按“2.2.3”项下色谱条件测定峰面积，以阿魏酸μg数为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得标准曲线，回归方程为：Y＝69.736X-0.1048，r＝0.9999。结果表明阿魏酸在0.0634～0.6336μg／mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

取阿魏酸对照品溶液（0.021mg·mL-1），按“2.2.3”项下色谱条件重复进样6次，结果，阿魏酸峰面积积分值的RSD＝1.32%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取阿魏酸对照品溶液（0.021mg·mL-1），按“2.2.3”项下色谱条件，于0、4、8、16、24h测定，结果，阿魏酸峰面积积分值的RSD＝1.05%（n＝6），表明对照品溶液在24h内稳定性良好，能满足测定要求。

2.2.7 重复性试验

取同一批号阿魏酸提取物（批号：101225），分别平行精密称取6份，按“2.2.3”项下色谱条件测定，结果，提取物中阿魏酸的平均含量为8.32%，RSD＝0.86%，表明方法重复性良好。

2.2.8 回收率试验

精密称取阿魏酸提取物（批号：101225，含量为8.32%），采用加样回收试验法，按标示量的80%、100%、120%，设计回收试验，共测定3组浓度9份样品，结果阿魏酸的平均回收率98.21%，RSD＝1.12%（n＝6）。

2.2.9 样品含量测定

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件，测定阿魏酸色谱峰峰面积积分值，计算阿魏酸的含量，并按下式计算阿魏酸的提取率：提取率（%）＝提取物中阿魏酸的质量／药材中阿魏酸的质量×100%。结果见表1。

表1 不同提取方法阿魏酸含量比较

表1结果显示，阿魏酸提取率以超临界CO2萃取法＞渗漉法＞醇提法。采用超临界CO2萃取法，提取物中阿魏酸含量可达到24.50%。综合考虑，确定川芎采用超临界CO2萃取法进行提取。

2.3 提取工艺优选

2.3.1 药材粒度选择

尽管超临界CO2液体扩散速度比一般液体快得多，但它跟一般的溶剂萃取有相同的特性，即原料粒度对传质效率有一定的影响。一般来说，粒度小时，CO2传质面积大，有利于液体CO2向物料内部渗透，减少扩散距离，提取效率较高；但若物料过细，在高压下易被压实而增加了传质阻力，从而使萃取效率下降。预试验结果表明，川芎细粉的超临界CO2提取率仅为粗粉的70.32%，根据设备性能和药材特点，确定药材粒度为粗粉。

2.3.2 夹带剂加入量选择

夹带剂确定为乙醇，加入方法为一步法［3］，分别加入药材：乙醇（4：0、4：2、4：4、4：6、4：8）夹带剂，固定萃取压力40.0 MPa，萃取温度50℃，解析压力6MPa，解析温度45℃，动态萃取2h，收集提取物，测定阿魏酸的含量，计算提取率。结果见表2。

表2 夹带剂用量对阿魏酸提取率的影响

试验结果表明，药材：乙醇用量分别为4：6和4：8时，阿魏酸提取率几无差异。因此，夹带剂用量确定为药材量的1.5倍。

2.3.3 均匀试验设计

超临界萃取流速一般采用固定值22L／h，解析温度对结果影响较小，故采用均匀设计法对影响川芎中阿魏酸提取率的萃取压力、萃取温度、提取时间等因素进行考察，优选最佳工艺条件。按实验条件将3个因素等分为7个水平，因素水平见表3。按照U7（74）均匀设计安排试验，均匀设计结果见表4。

表3 因素水平

表4 川芎均匀实验结果

将表4中数据运用均匀设计软件进行二项多项式逐步回归分析，得回归方程：Y＝-12.4+8.65 X1-1.54 X2+9.82 X3-0.32+3.89 X1X3-1.08 X2X3。最高指标时各个因素组合：X1＝1.2；X2＝9.98；X3＝105.6，显著水平P＝0.005，统计量值F＝18.7，相关系数R＝0.962，调整后的相关系数R＝0.9452，表明方程拟合度良好，因素显著。用上述回归方程作为目标函数进行优化，优化结果为：萃取压力45MPa，萃取温度55℃，提取时间3.5h。

2.3.4 验证试验

取川芎粗粉300g，平行3份，装入萃取罐中，按优选工艺条件（即萃取压力45MPa，萃取温度55℃，解析压力6MPa，解析温度45℃，加入1.5倍药材量乙醇）进行提取，提取3.5h，收集提取物，测定阿魏酸的含量，计算出阿魏酸提取率为（92.21±0.15）%，证明优选的工艺重现性好，合理，可行。

3 讨论

（1）川芎中所含酚酸类成分专属性较强，其中阿魏酸是川芎中具有代表性的活性成分。采用高效液相色谱法测定提取物中阿魏酸的含量，比较不同提取方法川芎中阿魏酸的提取率，结果显示超临界CO2萃取法阿魏酸提取率最高，且超临界CO2萃取法萃取温度低，防止阿魏酸的分解，故可适用于川芎中阿魏酸的提取。

（2）均匀设计是一种多因素与多水平试验的设计方法，具有“均匀分散，试验次数少”的特点，试验次数与水平数相等［5］，且试验结果可用计算机处理，通过回归方程得出最佳实验条件。本研究采用均匀设计法优选阿魏酸超临界CO2提取最佳工艺条件，主要考察了萃取压力、萃取温度、提取时间等主要影响因素。由于本试验无需二次分离，故固定解析压力6MPa。

（3）由于超临界CO2流体是极性小的溶剂，对亲脂性物质溶解度大，对极性大的阿魏酸溶解度较小，可在超临界CO2流体中加入一定量的夹带剂，可改变分子间的亲和力，达到改变溶剂的极性、增加溶质溶解度的目的，可大大提高提取效率［6］。根据文献报道，常用的夹带剂有甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，但仅乙醇为无毒性溶剂，且对阿魏酸提取效率较高［3］，故采用乙醇为夹带剂。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：化学工业出版社，2010：38.

［2］崔丽娟，刘玉明.正交试验法优选川芎中阿魏酸的提取工艺［J］.齐鲁药事，2005，24（9）：560.

［3］孙永跃，李淑芬，宋慧婷，等.超临界CO2萃取川芎中药效成分研究［J］.化学工程，2006，34（3）：60-63.

［4］魏玉平，刘俊，王永富，等.川芎中活性成分的提取工艺建立与综合评判［J］.中草药，2005，36（1）：53-54.

［5］李俭红，钟丽萍，陈虎，等.用均匀设计法优选知母总皂苷的提取工艺［J］.中国药房，1999，10（1）：15.

［6］王东成.中药超临界流体萃取的特点及影响因素［J］.机电信息，2005（4）：25-27.