胶体金免疫层析法和气相色谱法测定动物产品中氯霉素残留

宋红波，陈 军，王 栋，方 琳，余文婕，储 芳

(江苏省产品质量监督检验研究院溧阳检测中心，溧阳市农畜水产品质量监督检验测试中心，江苏 溧阳 213300)

胶体金免疫层析法和气相色谱法测定动物产品中氯霉素残留

宋红波，陈 军，王 栋，方 琳，余文婕，储 芳

(江苏省产品质量监督检验研究院溧阳检测中心，溧阳市农畜水产品质量监督检验测试中心，江苏 溧阳 213300)

对动物产品中氯霉素残留检测的胶体金免疫层析法和气相色谱法进行比较研究。向样品中分别添加0.3、0.5、1.5μg/kg三个添加水平的氯霉素标准品，用两种方法进行检测。胶体金免疫层析法对0.5μg/kg以上均能检出，气相色谱法平均回收率分别为78.1%、85.3%和88.3%，变异系数为5.3%～9.0%，最低检测限为0.3μg/kg。对108个样品用胶体金免疫层析法筛选出3个阳性样品，经气相色谱法验证皆为阳性，105个阴性样品经气相色谱法检测皆为阴性，未发现假阳性和假阴性。结果表明：胶体金免疫层析法具有快速，简便，特异，灵敏度高的特点，适合基层检验机构对动物产品中氯霉素残留现场快速筛选；气相色谱法灵敏度高，适用于阳性样品的精确定量。

动物产品；氯霉素；胶体金免疫层析法；气相色谱法

氯霉素是一类广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抑制作用，由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，曾作为细菌性疾病的治疗药物广泛应用于人和动物临床[1]。然而研究发现氯霉素对人体的造血系统毒害极大，同时具有肝脏毒性[2]。许多国家已禁止氯霉素在动物生产中使用，联合国粮农组织也建议在畜牧业生产中停止使用氯霉素[3]，欧盟规定进口水产品中氯霉素不得检出[4]。因此，探讨快速、便捷的氯霉素残留检测方法也引起了世界各国的广泛关注。

目前氯霉素残留分析方法很多[5-6]，主要有酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[7-9]、气相色谱法(gas chromatography，GC)[10]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[11-12]、气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometer， GC-MS)[13-14]、液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS-MS)[15]，胶体金免疫层析法(gold immunochromatographic assay，GICA)[16]亦可见报道。本实验对胶体金免疫层析法和气相色谱法测定动物产品中氯霉素残留的方法进行比较研究，并对方法的回收率、精密度及检测限进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 样品及制备

实验样品为冻鸡肉、冻鱼肉、冻虾仁，均购自市场。其中鸡肉50份，鱼肉30份，虾仁28份。将样品去皮、去骨后取肌肉，制成均质物，储存于－18℃备前处理用。

1.1.2 试剂

氯霉素标准品(纯度99.5%) 德国Dr Ehrenstorfer公司；氯霉素胶体金免疫层析法试剂盒(包括反应孔48个、氯霉素指示剂1瓶、检测试纸片48片、10倍浓缩稀释缓冲液) 大连普瑞康生物技术有限公司；C18固相萃取柱(填料量500mg，3mL)；乙酸乙酯、乙腈、正己烷(均为农残级) 美国Tedia公司；4g/100mL氯化钠溶液；BSTFA＋TMCS (99:1)衍生化试剂 美国Supelco公司。

1.1.3 仪器与设备

6890N型气相色谱仪(配ECD检测器) 美国安捷伦公司；JA-5002电子天平 上海精天电子仪器厂；AllegraTM21R台式高速冷冻离心机.. 美国Beckman公司；R-205旋转蒸发仪 德国Bu chi公司；漩涡混合器、NEVAP-11155氮吹仪、固相萃取SPE装置、微量移液枪。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

GICA法：称取样品3g(精确到0.01g)，用6mL乙酸乙酯提取，3000r/min离心后吸取乙酸乙酯2mL置于10mL刻度离心管，氮气流吹干；先用2mL正己烷溶解残渣，再加入1mL稀释缓冲液，漩涡混合10s，3000r/ min离心10min，弃去上层正己烷层，下层水相备用。

GC法：称取样品5g(精确到0.01g)，用乙酸乙酯30mL分2次提取，速度离心4000r/min，将提取液乙酸乙酯层合并转移到100mL细口鸡心瓶中，于温度40℃水浴中，减压旋转蒸发至干。向鸡心瓶中加15mL、4g/ 100mL氯化钠溶液，再用20mL正己烷分两次脱脂，除去上层正己烷相，水相保留备用。给每个样品准备一根C18柱，依次用5mL甲醇和5mL水活化，将上一步脱脂得到的水相溶液注入C18柱，弃去流出液，用3mL水洗涤并抽干小柱，再用4mL乙腈将C18小柱中的氯霉素洗脱至5mL具塞离心管中，用氮气吹干。加100μL衍生化试剂，盖塞并旋涡混合10s，在60℃烘箱中反应30min。用氮气流吹除多余的试剂，至样品管刚好吹干为止。加入1mL正已烷定容，供GC(ECD)检测。

1.2.2 GICA法分析步骤

用微量移液器吸取70μL水相溶液加入反应孔中，然后以试剂盒自带小吸管加入氯霉素指示剂1滴(使用前充分摇匀)，充分振荡混合5min。于待测反应孔中放入试纸片(白色端在下)，跑片10min后按按照试剂盒说明判定结果，判定时间不宜超过20min。

1.2.3 GC法测试条件

色谱柱：填料35%聚二苯基二甲基硅氧烷(DB-35)毛细管柱，规格长：30m，内径0.25mm或0.32mm，膜厚0.25μm；载气：氮气；流量：1.2mL/min；尾吹气流量：60mL/min；进样口温度：260℃；柱温：采用程序升温：初温80℃，维持1min；30℃/min升至200℃，维持0min；然后6℃/min升至250℃，维持5min；最后设定30℃/min升至270℃，维持5min以确保所有的化合物已经流出；检测器温度：300℃；进样方式：不分流进样，分流吹扫时间0.75min；进样量：1μL。

1.2.4 GC法精密度和准确度

方法准确度以回收率表示，而精密度以变异系数来表示。向空白样品中分别添加0.3、0.5、1.5μg/kg三个水平的氯霉素标样，每个添加量至少做3个平行，同时做3个空白样。按1.2.1节方法进行前处理，气相色谱法检测定量，计算回收率及各添加水平的变异系数。

1.2.5 GICA方法验证

称取样品5g(精确到0.01g)，向样品中分别添加10μg/L氯霉素标样150、250、750μL，即添加水平为0.3、0.5、1.5μg/kg三个水平，每个水平设16个平行，同时做8个空白样，按1.2.1节前处理和1.2.2节测定。

用胶体金免疫层析法对108个禽、水产品进行筛选，阳性样品用气相色谱法验证，阴性样品同时用气相色谱法测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

图1 氯霉素标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of chloramphenicol standard

氯霉素标准曲线：以1、10、20、50、100μg/L氯霉素标准工作液衍生后进样，测定其峰面积值，以峰面积对质量浓度做工作曲线。结果表明氯霉素保留时间为15.41min，在1～100μg/L质量浓度范围内呈良好线形关系，回归方程为Y＝4×106x＋2×107，r2＝0.997。气相色谱仪检测氯霉素标准品的色谱图见图1。

2.2 GC法精密度和准确度

实验的准确度以回收率表示，精密度以变异系数来表示，加标量为0.3、0.5、1.5μg/kg，精密度和准确度见表1。

表1 GC法测定的准确度和精密度测定结果Table 1 Accuracy and precision of GC

从表1可看出，向样品中添加0.3、0.5、1.5μg/kg三个水平的氯霉素标准品时，平均回收率分别为78.1%、85.3%和88.3%，变异系数为5.3%～9.0%，方法重复性较好。

2.3 GICA法检测结果

GICA法的原理是将特异性抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该硝酸纤维素膜一端浸入样品时，由于毛细管作用，样品沿着膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体特异性结合，使免疫胶体金染色的该区域显示一定的颜色，从而实现特异性免疫诊断。

向空白样品中分别添加0.3、0.5、1.5μg/kg三个水平的氯霉素标样，每个水平设16个平行，同时做8个空白样，按1.2.1前处理和1.2.2节测定，结果见表2。

表2 GICA法样品检测结果Table 2 Results of sample detection by GICA

从表2可知，8个空白样品检测结果为阴性；16个添加0.3μg/kg氯霉素标准品的样品，经检测有2个样品为阳性，14个样品为阴性；添加0.5、1.5μg/kg氯霉素标准品的样品，检测结果为阳性，检出率为100%。

2.4 检测限

胶体金免疫层析法试剂盒检测限：取试剂空白、0.30、0.60μg/L的氯霉素标准品各8份，按1.2.2节测定，结果见表3。

表3 GICA法标准品检测结果Table 3 Results of standard CPA detection by GICA

由表3可知，胶体金免疫层析法对0.3μg/L及以上质量浓度的标准品均能检出，试剂盒检测限为0.3μg/L。

样品检测限：从表2看出，向16个样品中添加0.5μg/kg水平的氯霉素标准品均能检出，初步确定该法检测限至少为0.5μg/kg。根据《农业部公告781-1－2006动物源食品中氯霉素残留量的测定：气相色谱-质谱法》(确证方法)中定量限为0.5μg/kg，GICA法的检测限能满足筛选要求。

气相色谱法最低检测限按照信噪比RSN＝3计算，得该方法检测限为0.3μg/kg。

2.5 GICA法和GC法检测实际样品结果比较

用胶体金免疫层析法对108个禽、水产品进行检测，筛选出3个阳性样品(按检测限0.5μg/kg判定)，用气相色谱法验证亦为阳性；其余105个样品用胶体金免疫层析法筛选为阴性，经气相色谱法检测均为阴性(检测限0.3μg/kg)，结果见表4。

表4 GICA法和GC法检测结果比较Table 4 Comparison of determination results of chloramphenicol residues in 108 samples by GICA and GC

由表4可见，GICA法筛选出的3个阳性样品经GC检测结果均在0.5μg/kg以上，而阴性样品均低于0.3μg/kg，显示两种检测方法结果的吻合度较高。其中阳性鸡肉样品氯霉素浓度在检测限附近，用GICA法亦能明显判为阳性。表4的结果表明GICA法筛选假阳性率和假阴性率都为0，适用于动物产品中氯霉素残留筛选。

3 讨 论

目前对动物产品中氯霉素残留的主要方法为气相色谱法、气质联用法、液质联用法、液相色谱法、酶联免疫法，而胶体金免疫层析法的运用才刚刚起步。气相色谱法、气质联用法、液质联用法灵敏度高、准确性好，但前处理繁琐，检测成本高，且需要昂贵的仪器；液相色谱法检测限过高，达不到出口产品残留限要求，目前使用不多；酶联免疫法是目前广泛使用的氯霉素残留筛选方法之一，其精密度与准确度都很高，但阳性结果仍需经气相色谱法、气质联用法确证。

用胶体金免疫层析法对动物产品中氯霉素残留进行筛选，能在几小时内检测几十到上百个样品，且不需要复杂的仪器设备，样品预处理简单，检测成本低，作为一种快速筛选手段，能大大提高检测效率，在现场监控和基层检测中有着广阔的推广应用前景。但目前筛选法的检测标准极少，检测限(即阳性浓度标准)不统一，给检测结果判定带来一定困难，对筛选可疑结果需用色谱方法进行确证。

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Comparative Applications of Colloidal Gold Immunochromatographic Assay and Gas Chromatography for the Determination of Chloramphenicol Residues in Food Products of Animal Origin

SONG Hong-bo，CHEN Jun，WANG Dong，FANG Lin，YU Wen-jie，CHU Fang

(Liyang Testing Center, Institute of Supervision and Inspection Product Quality of Jiangsu Province, Liyang Agricultural, Domestic and Aquatic Products Quality Supervision and Testing Center, Liyang 213300, China)

Colloidal gold immunochromatographic assay (GICA) and gas chromatography (GC) was separately used for the analysis of chloramphenicol (CAP) residues in creatural products. Samples were spiked with 0.3, 0.5μg/kg and 1.5μg/kg CAP and determined by the methods. CAP residues at concentrations above 0.5μg/kg could be detected by GICA. The average recovery rates of GC were 78.1%, 85.3% and 88.3%, respectively with relative standard deviation (RSD) of 5.3%－9.0% and the detection limit was 0.3μg/kg. Three positive samples and other 105 samples analyzed by GICA were confirmed by GC and no false positive and negative samples were observed. Therefore, GICA is a rapid, accurate, reproducible and suitable to be used for rapid in situ screening of CAP residues in food products of animal origin, while GC is sensitive and suitable to be used for quantification of positive samples.

food products of animal origin；chloramphenicol；GICA；GC

TS207.3

A

1002-6630(2012)08-0229-04

2011-04-05

宋红波(1980—)，女，助理研究员，硕士，主要从事食品安全检测技术研究。E-mail：lichenlsong@yahoo.com.cn