响应曲面法优化仲丁胺气相色谱检测的衍生条件

纪淑娟，于兰洁，刘 玲，白 冰，周 丹

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

响应曲面法优化仲丁胺气相色谱检测的衍生条件

纪淑娟，于兰洁，刘 玲，白 冰，周 丹

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

利用响应面法优化仲丁胺气相色谱检测的衍生条件。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，针对试验中衍生化反应这一重要环节，在单因素试验基础上，以仲丁胺回收率为响应值，应用响应曲面法研究衍生反应时间、温度、衍生剂用量各因素间的交互作用及其对仲丁胺测定回收率的影响。以五氟苯甲醛溶液作为衍生剂，经气相色谱电子捕获检测器分析测定。确定最佳衍生条件为：衍生反应时间31.72min、衍生反应温度22.42℃、衍生剂用量1.25mL。

仲丁胺；残留；衍生；响应曲面法；气相色谱

仲丁胺(sec-butylamine，2-AB)，分子式为CH3CH (NH2)C2H5，是具有对映异构现象的简单二级胺，有刺激性氨臭味，呈无色液体状，有较强的挥发性。可以任意比例与水混溶并可溶于多种有机溶剂[1-3]。仲丁胺具有一定的毒性，人们食用含有仲丁胺的食品后，可随尿液排出一部分，另一部分积累在肾脏中。动物试验表明，白鼠(rat)的半致死剂量(LD50)为380mg/kg，美国将其归为三级危险品。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)规定仲丁胺的每日允许摄入量(acceptable daily intake，ADI)为0～0.1mg/kg[4]。

仲丁胺可以有效地抑制根霉、青霉和绿霉等真菌的生长和繁殖，我国允许其在一定范围内用作果蔬防腐保鲜剂，目前，主要应用于柑橘、柠檬、苹果、蒜薹、青椒等果品蔬菜的贮运保鲜。GB 2760—2011《食品添加剂使用卫生标准：蒜薹、青椒、柑橘、葡萄中仲丁胺残留量测定》规定仲丁胺残留的限量标准为：柑橘果肉0.005mg/kg、荔枝果肉0.009mg/kg、苹果果肉0.001mg/kg；新鲜蔬菜(蒜薹和青椒)3mg/kg。目前，我国检测仲丁胺残留的标准方法为NY/T 946—2006《蒜薹、青椒、柑橘、葡萄中仲丁胺残留量测定》，该方法采用薄层色谱法，检出限较高。本实验采用仲丁胺衍生化后气相色谱法测定的技术路线，重点对衍生反应条件进行优化筛选，以期为建立可靠、稳定、灵敏的仲丁胺残留量检测方法奠定基础[5-8]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正己烷(色谱纯)、乙腈(色谱纯) 杭州阿拉丁公司；仲丁胺(纯度≥99.5℅) 四川西亚试剂；五氟苯甲醛(≥98%) 美国Acros公司；氢氧化钠(分析纯) 中国国药集团；无水硫酸钠(分析纯) 沈阳化学试剂厂；聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP 分析纯) 德国Sigma公司；DB1701毛细管柱 美国Agilent公司。

1.2 仪器与设备

CP3800气相色谱仪 美国Varian公司；涡旋震荡仪 德国IKA公司；HY-2调速多用振荡器 常州国华电器有限公司；KQ5200超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 衍生

衍生剂的配制：准确称取0.5μL五氟苯甲醛(PFB)，用乙腈定容至10mL，体积分数0.05μL/mL。

在10mL仲丁胺标准溶液中加入1mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，使体系处于pH12的碱性环境，摇匀后加入衍生剂溶液，在一定温度下恒温反应一定时间后，用2mL正己烷分两次振荡提取衍生产物五氟苄亚胺，收集提取液，加入1mL 0.1mol/L氢氧化钠，洗涤未反应完全的衍生剂，收集正己烷，用无水硫酸钠脱水，供气相色谱仪测定[9-11]。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：DB1701毛细管柱(30m×320μm，0.25μm)，不分流进样，载气为高纯度氮气(99.999%)，升温程序：以80℃为初始温度，保持5min，以3℃/min升温至130℃，再以20℃/min，升温至250℃，保持10min，全程33.52min，进样口温度：250℃，检测器温度：350℃，流速1.5mL/min，进样量1.0μL，外标法定量[11-16]。

1.3.3 标准曲线的绘制

0.1mg/kg仲丁胺标准储备溶液：准确量取仲丁胺标准品1.39μL，用蒸馏水定容至10.0mL，准确移取其中1.0mL，蒸馏水定容至10.0mL，依次10倍比例稀释，最终得到0.1mg/kg仲丁胺标准储备液。

分别移取0.1mg/kg仲丁胺标准储备液1、2、3、4、5、6mL于10.0mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到含量分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/kg的仲丁胺标准工作液，衍生后测定，绘制标准曲线。

1.3.4 试验设计与分析方法

应用Minitab 15 中文软件对试验数据进行分析[17-20]。

2 结果与分析

2.1 仲丁胺标准曲线

不同质量浓度的仲丁胺标准溶液经气相色谱测定，得标准曲线如图1所示，线性回归方程为：y＝1297.3x＋48.503，R2＝0.9966(x为质量浓度(mg/mL)，y为峰面积)。当仲丁胺质量浓度在0～0.06mg/mL时，其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

图1 仲丁胺标准曲线Fig.1 Standard curve of sec-butylamine

2.2 单因素试验

2.2.1 衍生反应温度的筛选

在衍生时间30min、衍生剂用量1mL条件下考察衍生温度对衍生反应效果的影响，结果见图2。

图2 衍生反应温度对回收率的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on recovery rate of sec-butylamine

由图2可知，衍生反应温度在20～30℃范围内，仲丁胺的回收率比较平稳，且均高于85%，当温度超过30℃时，回收率呈急剧下降趋势。因此，初步确定衍生反应的适宜温度20～30℃。

2.2.2 衍生反应时间的筛选

在反应温度25℃、衍生剂用量1mL条件下考察衍生时间对回收率的影响，结果见图3。

由图3可见，当衍生反应时间为20～50min时，仲丁胺的回收率均可达到80%以上；当衍生时间超过50min时，仲丁胺的回收率随反应时间的延长而大幅下降。这可能是由于时间过长，衍生反应产物部分分解损失的缘故。因此，初步确定反应时间在20～50min较为适宜。

图3 衍生反应时间对回收率的影响Fig.3 Effect of reaction time on recovery rate sec-butylamine

2.2.3 衍生剂用量的确定

在反应温度25℃、反应时间30min条件下，考察衍生剂用量对回收率的影响，结果见图4。

图4 衍生剂用量对回收率的影响Fig.4 Effect of derivatization reagent on recovery rate of sec-butylamine

图4表明，衍生剂用量对检测效果影响较大，随着衍生剂用量的增加，回收率呈逐渐递增的趋势，其中，衍生剂用量为0.5mL时，回收率低于70%，衍生剂用量为0.75～1.25mL时，仲丁胺的回收率在80%～120%之间，而当衍生剂用量超过1.25mL时，回收率大于120%，可能是由于过量的衍生剂本身对测定产生干扰的缘故。因此，初步确定适宜的衍生剂用量为0.75～1.25mL。

2.3 响应曲面法优化衍生反应条件

2.3.1 仲丁胺衍生反应条件的试验设计

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，对反应时间、反应温度、衍生剂用量三个衍生反应关键因素进一步进行优化。试验中，采用三因素三水平响应面分析法，重复3次，以随机次序进行的15个试验点可以分为两类，第1类是12个析因点，自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点；第2类是3个零点，为区域的中心点，用以估计试验误差。因素与水平设计见表1，响应面分析方案及试验结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels for response surface analysis

表2 仲丁胺衍生反应响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

将表2中不同条件下所测得的仲丁胺回收率，应用Design Expert 7.1统计软件进行回归拟合，根据表3中显示的方程中各项P值的显著性，去掉P值不显著项，得到仲丁胺回收率的回归方程：Y＝99.4－0.975X2＋31.925X3－1.25X1X2－4.35X1X3－11X12－8.65X22。

2.3.2 模型方差分析

利用Design Expert 7.1 统计软件进行二次多元回归拟合，得到回归方程模型的方差分析和回归方程系数估计值，如表3所示。

由表3可知，3个因素的P值相差较大，对回收率结果的影响顺序为：衍生剂用量(X3)＞衍生温度(X2)＞衍生时间(X1)，其中衍生剂用量和衍生温度的一次项回归系数达到极显著水平；衍生温度(X2)和衍生时间(X1)的二次项回归系数达到极显著水平；衍生时间(X1)与衍生温度(X2)、衍生时间(X1)与衍生剂用量(X3)的二次项回归系数达到极显著水平，说明他们之间存在明显交互作用。

表3 二次回归方程系数显著性检验Table 3 Significance test of regression equation coefficients in the fitted regression model

表4 中心组合设计二次模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression model

从表4可知，模型P＜0.01，达到极显著，表明不同处理之间差异极显著。模型失拟项P＝0.074＞0.05，模型失拟项不显著，模型选择合适。由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。相关系数R2＝99.42%＞0.8，说明回收率实际值与预测值之间具有较好的拟合度，表明该数学模型中3个因素对仲丁胺回收率的影响达0.9942%，而其他因素的影响和误差占0.58%，即只有0.58%的变异不能由该模型解释，因此该模型可用于预测响应值仲丁胺回收率的实际情况。2.4 双因素交互作用分析

图5 各因素交互作用对仲丁胺回收率影响的响应面图与等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of derivatization conditions on recovery rate of sec-butylamine

为了分析任意两因素交互作用的影响，固定三个因素中任意一个因素在零水平，研究另两个因素的交互效应，其响应面与等高线图见图5。

如图5A所示，在反应时间处于较低水平的情况下，随着反应温度的升高，回收率呈现从急剧升高到急剧降低的变化趋势，而在衍生反应时间较长时，随着反应温度的升高，回收率呈现从急剧下降到急剧升高的趋势。上述变化趋势说明衍生反应时间与温度之间存在着显著的交互作用，不同的衍生反应时间与温度的组合，会导致回收率发生较大变化。从图1可以看出，衍生反应温度相比反应时间，对回收率有更强的影响。

如图5B所示，在衍生剂用量处于较低水平时，回收率呈现较低水平，但仍随着反应时间的延长呈现先升高后降低的趋势，而在衍生剂用量处于较高水平的情况下，回收率显现较高水平，并随着反应时间的延长显现稳步上升的趋势，上述变化趋势说明衍生反应时间与衍生剂用量之间存在显著的交互作用，不同水平的衍生反应时间与衍生剂用量的组合，会导致不同的响应值变化。

如图5C所示，在衍生反应温度处于较低水平时，随着衍生剂用量的增加回收率显现急剧增加的趋势，而在反应时间处于较高水平的情况下，随着衍生剂用量的增加回收率仍显现较大幅度的增加，上述变化趋势说明衍生反应温度与衍生剂用量之间不存在显著的交互作用。

3 讨 论

衍生反应条件直接关系到仲丁胺的检测效果。本实验通过响应面设计方法，考察了衍生反应温度、时间以及衍生剂用量对仲丁胺衍生效果的影响，优化了衍生反应条件。结果表明，多元二次回归方程的模型回归显著，且失拟性检验不显著，说明通过本试验所建立的二次回归方程成功地反映了所考察的三个因素与响应值之间的相关性。在仲丁胺衍生并测定过程中，衍生反应时间、温度及衍生剂用量都是影响仲丁胺回收率的关键因素，三个因素的影响顺序为：衍生剂用量＞衍生温度＞衍生时间。并且反应时间与温度、反应时间与衍生剂用量的交互作用对回收率的影响极为显著。各因素的最佳条件为：衍生时间31.72min、衍生温度22.42℃、衍生剂用量1.25mL，理论回收率为112%。以衍生时间31.7min、衍生温度22.4℃、衍生剂用量1.25mL，进行衍生反应试验得到平均回收率为(108±1.71)%，与软件预测的回收率数值较为接近。

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Optimization of Derivatization Conditions for Gas Chromatographic Determination of Sec-Butylamine by Response Surface Methodology

JI Shu-juan，YU Lan-jie，LIU Ling，BAI Bing，ZHOU Dan

(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Derivatization reaction is very important for the determination of sec-butylamine. For the purpose of establishing a gas chromatography-electron capture detection (GC-ECD) method for determining sec-butylamine, the optimal derivatization reaction conditions were studied by response surface methodology. Based on the results of one-factor-at-a-time experiments, a central composite design was used to investigate the pairwise interaction effects of reaction time, temperature and derivatization reagent (acetonitrile containing 0.05μL/mL pentafluorobenzaldehyde) amount on sec-butylamine recovery. The optimal derivative temperature, derivative duration and derivatization reagent amount were found to be 22.42 ℃, 31.72 min and 1.25 mL, respectively.

sec-butylamine；residue；derivatization；response surface methodology；gas chromatography

TS207.3

A

1002-6630(2012)08-0211-05

2011-06-27

农业部行业标准制定项目(2130109)

纪淑娟(1960—)，女，教授，博士，主要从事食品质量控制。E-mail：jsjsyau@sina.com