超高压结合酶法消减南美白对虾蛋白过敏原研究

谢丹丹，胡志和*，薛 璐，张博洋，宿文晶，方 缘

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

超高压结合酶法消减南美白对虾蛋白过敏原研究

谢丹丹，胡志和*，薛 璐，张博洋，宿文晶，方 缘

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

以南美白对虾为研究对象，提取水溶性虾蛋白，采用超高压法、超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解、超高压下直接酶解等方法消减其过敏原蛋白，用间接酶联免疫吸附法检测过敏原消减效果，确定消减过敏原的条件。结果表明：采用超高压法处理，其最佳条件为压力150MPa、温度45℃、保压时间35min，产物抗原抗体反应的OD492nm值为0.1997；高压结合木瓜蛋白酶水解法最佳条件为：350MPa、温度45℃、保压时间20min，产物抗原抗体反应的OD492nm值为0.0492；超高压下直接用木瓜蛋白酶处理，其最佳条件为：压力300MPa、温度45℃、保压时间35min，产物抗原抗体反应的OD492nm值为0.05。由此可见，高压对过敏原蛋白有消减作用，先高压再水解和超高压下直接酶处理对过敏原的消减效果更好。

南美白对虾；高压法结合酶法；过敏原消减；酶联免疫

随着社会的进步和全球化进程的发展，食物过敏性疾病的发病率越来越高。根据统计，美国大约有6%的幼儿和3.7%的成年人对某些食品过敏[1-2]，其中海产品就是引起过敏的食品中的一种[3-4]。有研究表明，学龄儿童中的食物过敏现象呈上升趋势，相关调查报告显示，在2007年美国大约有300万的学龄儿童有食物过敏现象，相比1997年过敏人数增加了18%，另外还有很多与此相关的报道[5-6]。我国虽然在这方面还没有进行过比较系统的调查，但近几年也出现了很多关于食用海产品致敏的报道[7-10]。食物过敏已经严重的威胁到人类的健康，甚至会对人类的生命安全造成很大的伤害[11]。本研究以南美白对虾为原料，抽提水溶性蛋白，在消除虾肉其他成分影响的条件下，研究超高压法、超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解、超高压条件下直接用木瓜蛋白酶水解的方法处理海虾过敏原蛋白，比较其消减效果，为生产低过敏海虾制品提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜活的南美白对虾 市售；海虾过敏人血清(3名过敏者混合血清)及非过敏人血清(30名非过敏者血清的混合)天津商业大学校医院，血清置于－25℃冰箱冻存。

木瓜蛋白酶(papain，0.5～2U/mg)、HRP 标记的羊抗人IgE抗体A9667 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HPP.L3型超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；UV-2100紫外分光光度计 尤尼克仪器有限公司；DK-42型电热恒温水浴槽 上海精宏实验设备有限公司；PB-10 pH计 德国赛多利斯北京有限公司；3-18K型离心机 美国Sigma公司；Scientz-50N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；FA1104N 型电子天平 上海精密科技仪器有限公司；RT-6000 型酶标分析仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木瓜蛋白酶活力测定

在试管中各加入5mL 1%的酪蛋白溶液。测定温度下预热10min，加入酶液1mL，摇匀，水浴反应10min，各加入4mL 20%的三氯乙酸溶液终止反应，摇匀，水浴放置30min，然后过滤，滤液用紫外法测定。空白对照是在酪蛋白溶液中先加三氯乙酸，再加酶液，其他过程相同[12]。

1.3.2 过敏原的提取

将南美白对虾去头去尾去壳去肠线后放在匀浆机中匀浆，每克组织用1mL的生理盐水来悬浮，悬浮液置于冰上5min后加入4倍体积冷丙酮(—20℃预冷过夜)，充分混匀，放在 0℃作用 30min，期间混匀数次。4℃、10000r/min离心15min，将沉淀物移至干净滤纸上，分散并自然风干，即为丙酮粉。丙酮粉与1mol/L KCl抽提液(含0.5mmol/L DTT)按1:10(m/V)的比例抽提过夜，4℃、10000r/min离心15min，取上清液，沉淀物与抽提液按1:10(m/V)抽提4h，离心取上清液，将两次的上清合并后透析过夜，再冷冻干燥，置于－20℃冰箱保存备用[13-14]。将该蛋白与包被液(100mL含0.16g Na2CO3，0.29g NaHCO3)配成质量分数1%的溶液，即为待测物。

1.3.3 间接酶联免疫检测方法

包被抗原时每个样品做6个平行孔，在酶标板上每孔加100μL待测物，置于4℃包被过夜。用洗液洗5次，每次3min，拍干。每孔加封闭液200μL(100mL PBST含1g BSA)，37℃水浴3h，洗涤后拍干，每孔加入100μL一抗(用封闭液稀释20倍的过敏人血清)，37℃水浴2h，洗涤后拍干，加入用HRP 标记的羊抗人IgE(用封闭液稀释200倍的二抗)，37℃水浴2h。洗涤拍干，每孔加邻苯二胺100μL，37℃显色15min，每孔加50μL终止液(2mol/L H2SO4)，最后在492nm波长下测定OD值[15]。

1.3.4 高压条件对木瓜蛋白酶活力的影响

压力对木瓜蛋白酶活性的影响：采用温度40℃，保压时间20min，改变压力(0、100、200、300、500MPa)；温度对木瓜蛋白酶活性的影响：采用压力200MPa，保压时间20min，改变温度(20、30、40、60℃)；保压时间对木瓜蛋白酶活性的影响：采用温度40℃、压力200MPa，改变保压时间(10、20、30、50min)。

1.3.5 高压法对南美白对虾过敏原蛋白消减效果的影响

1.3.5.1 单因素试验

采用保压时间20min、温度40℃，改变压力(100、200、300、500MPa)；采用保压时间20min、压力200MPa，改变温度(20、30、40、60℃)；采用压力200MPa、温度40℃，改变保压时间(10、20、30、50min)对过敏蛋白进行处理。将处理的产物进行冷冻干燥，再通过ELISA进行检测。

1.3.5.2 高压法对南美白对虾过敏原蛋白消减条件优化

根据单因素试验结果，以压力大小、温度以及保压时间为影响因素，以492nm波长处的OD值为考察目标(每组做6个平行，取均值)，进行L9(33)正交试验。因素水平见表1。

表1 高压法消减过敏原正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal array design for UHP treatment when used alone

1.3.6 高压处理后再用酶法消减虾过敏原蛋白

1.3.6.1 单因素试验

以压力大小、温度以及保压时间为影响因素。分别采用保压时间20min、温度40℃，改变压力(100、200、300、500MPa)；保压时间20min、压力300MPa，改变温度(20、30、40、60℃)；压力300MPa、温度40℃，改变保压时间(10、20、30、50min)对过敏蛋白进行处理。将处理完的产物进行冷冻干燥，然后对每个条件的产物按照温度60℃、pH6.5、底物质量浓度3g/100mL、酶与底物比1:100的条件用木瓜蛋白酶水解3h，再将水解产物离心后冷冻干燥，然后用ELISA检测。

1.3.6.2 高压处理后再用酶法消减虾过敏原蛋白条件优化

根据单因素试验结果，以压力大小、温度以及保压时间为影响因素，以492nm波长处的OD值为考察目标(每组做6个平行，然后取均值)，进行L9(33)正交试验，因素水平见表2。

表2 高压条件下酶解过敏原正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal array design for UHP treatment when used before papain hydrolysis

1.3.7 高压条件下用木瓜蛋白酶水解消减虾过敏原蛋白

将酶与虾蛋白同时进行高压处理，在1.3.4节和1.3.6节试验结果基础上，以压力大小、温度以及保压时间为影响因素，以492nm波长处的OD值为评价指标(每组做6个平行，然后取均值)，进行L9(33)正交试验。因素水平见表3。

表3 高压条件下酶解过敏原正交试验因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal array design for UHP treatment when used concurrently with papain hydrolysis

1.3.8 数据处理

应用SPSS17.0统计软件进行分析，所有数据用均数±标准差表示(±s)表示，P＜0.05，差异显著；P＞0.05，差异不显著。

2 结果与分析

2.1 高压条件对木瓜蛋白酶活性的影响

2.1.1 压力对木瓜蛋白酶活性的影响

将木瓜蛋白酶在不同压力下于40℃处理20min，其活性变化见图1。

由图1可知，压力对木瓜蛋白酶的活力有影响，当木瓜蛋白酶在0～500MPa、40℃下处理20min，随着压力的增加，木瓜蛋白酶的活性呈先上升后下降的趋势，在200MPa的压力作用下活性最高。

图1 40℃、20min条件不同压力对木瓜蛋白酶活力影响Fig.1 Effect of different pressure levels on papain activity at 40 ℃ for 20 min

2.1.2 温度对木瓜蛋白酶活性的影响

由图2可知，当木瓜蛋白酶在20～60℃、200MPa下处理20min，随着温度的增加，木瓜蛋白酶的活性逐渐降低。根据方差分析，在95%的置信区间，温度为20、30、40、60℃对木瓜蛋白酶活性的影响没有显著性差异。

2.1.3 保压时间对木瓜蛋白酶活性的影响

图3 200MPa、40℃条件不同保压时间对木瓜蛋白酶活性的影响Fig.3 Effect of different pressure dwell time on papain activity under 200 MPa at 40 ℃

由图3可知，当木瓜蛋白酶在40℃、200MPa处理0～50min，随着保压时间的增加，木瓜蛋白酶的活性先增加后下降。当保压时间为10min时，木瓜蛋白酶的活性最高。根据方差分析，在95%的置信区间，10、20min与不加压时的酶活存在显著性差异；20、30、50min与10min存在显著性差异； 10、20、30min与50min均存在显著性差异。

2.2 高压法对南美白对虾过敏原蛋白消减效果的影响

2.2.1 高压条件单因素试验

在对虾蛋白进行高压处理时，控制压力、温度和保压时间，其过敏原消减结果见图4。

图4 压力(A)、温度(B)和保压时间(C)对过敏原消减作用的影响Fig.4 Efects of pressure level, temperature and pressure dwell time on allergen elimination

由图4可知，在上述条件下，处理产物与抗体反应的OD492nm值较阳性对照的OD492nm值都有所降低。当压力不同时，压力200MPa时，处理产物与抗体反应的OD492nm值(0.3490)较低；当温度不同时，温度40℃时，处理产物与抗体反应的OD492nm值(0.3490)较低；当保压时间不同时，时间30min时，处理产物与抗体反应的OD492nm值(0.2863)较低。

2.2.2 高压法消减虾过敏原蛋白条件优化

由表4可知，通过高压处理虾蛋白所得的产物，经酶联免疫检测，得出3种因素对OD值的影响大小依次为A＞B＞C，即压力＞温度＞保压时间，较好的试验方案为A1B3C3，即压力150MPa、温度45℃、保压时间35min，此条件下处理产物与抗体反应的OD492nm值为0.1977。该值虽不在正常人血清与抗体反应的OD492nm值范围内，但是较阳性对照已经有很大程度的降低，说明超高压技术对虾蛋白中过敏原的消减起到了一定的作用。

表4 正交试验条件下高压处理过敏原的消减结果(±s)Table 4 Experimental scheme and results of orthogonal array design for UHP treatment when used alone (±s)

表4 正交试验条件下高压处理过敏原的消减结果(±s)Table 4 Experimental scheme and results of orthogonal array design for UHP treatment when used alone (±s)

实验号 A压力/MPa B温度/℃ C保压时间/min 平均OD492nm 1 1(150) 1(35) 1(25) 0.2608±0.0266 2 1 2(40) 2(30) 0.2654±0.0232 3 1 3(45) 3(35) 0.1977±0.0147 4 2(200) 1 2 0.2610±0.0155 5 2 2 3 0.2568±0.0161 6 2 3 1 0.2850±0.0163 7 3(250) 1 3 0.3342±0.0189 8 3 2 1 0.3238±0.0260 9 3 3 2 0.2858±0.0221 K1 0.7239 0.8560 0.8696 K2 0.8028 0.8460 0.8122 K3 0.9438 0.7685 0.7887 k1 0.2413 0.2853 0.2899 k2 0.2676 0.2820 0.2707 k3 0.3146 0.2560 0.2629 R 0.0733 0.0293 0.0270最优水平 A1 B3 C3

2.3 高压处理后再用酶法消减虾过敏原蛋白的效果

2.3.1 高压处理后再用酶法消减虾过敏原蛋白单因素试验

由图5可知，用高压处理虾蛋白，然后对每个条件的产物按照温度60℃、pH6.5、底物质量浓度3g/100mL、酶与底物比1:100(质量比)的条件进行水解3h，水解产物与抗体反应的OD492nm值较阳性对照的OD492nm值都有所降低。当压力300MPa时，产物与抗体反应的OD492nm值(0.0493)较低；温度40℃时，产物与抗体反应的OD492nm值(0.0493)较低；保压时间20min时，产物与抗体反应的OD492nm值(0.0493)较低。

图5 压力(A)、温度(B)和保压时间(C)对过敏原消减作用的影响Fig.5 Eliminating effects of different time on allergen under 300 MPa at 40 ℃

2.3.2 高压处理后采用酶法消减虾过敏原蛋白条件优化

表5 高压处理后采用酶法消减虾过敏原蛋白正交试验结果(±s)Table 5 Experimental scheme and results of orthogonal array design for UHP treatment when used before papain hydrolysis (±s)

表5 高压处理后采用酶法消减虾过敏原蛋白正交试验结果(±s)Table 5 Experimental scheme and results of orthogonal array design for UHP treatment when used before papain hydrolysis (±s)

试验号 A压力/MPa B温度/℃ C保压时间/min 平均OD492nm 1 1(250) 1(35) 1(15) 0.0525±0.0041 2 1 2(40) 2(20) 0.0497±0.0055 3 1 3(45) 3(25) 0.0500±0.0043 4 2(300) 1 2 0.0495±0.0063 5 2 2 3 0.0527±0.0034 6 1 0.0507±0.0063 7 3(350) 1 3 0.0508±0.0035 8 3 2 1 0.0510±0.0028 2 3 2 0.0492±0.0097 K1 0.1522 0.1983 0.1542 K2 0.1529 0.1535 0.1484 K3 0.1510 0.1499 0.1535 k1 0.0507 0.0661 0.0514 k2 0.0510 0.0511 0.0495 k3 0.0503 0.0500 0.0512 R 0.0007 0.0161 0.0019最优水平 A3 B3 C2 9 3 3

由表5可知，通过高压处理虾蛋白所得的产物，再经过木瓜蛋白酶水解(按照温度60℃、pH6.5、底物质量浓度3g/100mL、酶与底物比1:100的条件)，其水解产物经酶联免疫检测，得出3种因素对OD492nm值的影响大小依次为B＞C＞A，即温度＞保压时间＞压力，较好的试验方案为A3B3C2，即压力350MPa、温度45℃、保压时间20min，此条件下产物与抗体反应的OD492nm值为0.0492。该值在正常人血清与抗体反应的OD值范围内。

2.4 高压条件下用木瓜蛋白酶水解消减虾过敏原蛋白条件优化

表6 高压下用木瓜蛋白酶消减虾过敏原蛋白正交试验结果(±s)Table 6 Experimental scheme and results of orthogonal array design for UHP treatment when used concurrently with papain hydrolysis (±s)

表6 高压下用木瓜蛋白酶消减虾过敏原蛋白正交试验结果(±s)Table 6 Experimental scheme and results of orthogonal array design for UHP treatment when used concurrently with papain hydrolysis (±s)

试验号 A压力/MPa B温度/℃ C保压时间/min 平均OD492nm 1 1(200) 1(40) 1(20) 0.1017±0.0133 2 1 2(45) 2(35) 0.0633±0.0127 3 1 3(50) 3(50) 0.0752±0.0231 4 2(300) 1 2 0.0527±0.0083 5 2 2 3 0.0692±0.0329 6 2 3 1 0.0597±0.0163 7 3(400) 1 3 0.0553±0.0161 8 3 2 1 0.0625±0.0252 9 3 3 2 0.0687±0.0168 K1 0.2402 0.2097 0.2239 K2 0.1816 0.195 0.1847 K3 0.1865 0.2036 0.1997 k1 0.0801 0.0699 0.0746 k2 0.0605 0.065 0.0616 k3 0.0622 0.0679 0.0666 R 0.0196 0.0049 0.013最优水平 A2 B2 C2

由表6可知，通过高压结合酶法处理虾蛋白所得的产物，经酶联免疫检测，得出3种因素对OD492nm值的影响大小依次为A＞C＞B，即压力＞保压时间＞温度，最优试验方案为A2B2C2，即压力300MPa、温度45℃、保压时间35min，根据此条件进行验证实验，产物与抗体反应的OD492nm值为0.05，该值在正常人血清与抗体反应的OD值的范围内。

3 讨 论

我国已经有很多学者从南美白对虾中提取海虾的主要过敏原，王晓雯[13]、刘光明[16]等用海虾过敏者血清及阳性血清池鉴定36ku的蛋白为虾的主要过敏原，吴海明等[17]也对南美白对虾的主要过敏原进行了研究，认为主要过敏原为99、33、19、14ku的蛋白。

国内外也有很多关于消减虾过敏原的报道。顾可飞等[18]利用辐照对虾过敏原进行消减，发现虾过敏原经辐照处理后，免疫活性有所降低。李振兴[14]的研究发现当辐照剂量低于10kGy时，虾抽提物和虾肉的免疫活性有稍微增加；当辐照剂量大于10kGy时，虾过敏原蛋白的免疫活性下降。辐照和加热联合作用可以显著降低虾过敏原蛋白的免疫活性，同时他还对超声波消减虾过敏原进行了研究，发现在50℃条件下的超声波能够对虾的免疫活性产生明显的影响。经过1.5h的处理后，其免疫活性只有未处理虾肉的20%。李庆丽等[19]发现麦芽糖、葡萄糖均使虾过敏原蛋白免疫活性有所降低，其中，麦芽糖使虾过敏原蛋白活性下降了60%；葡萄糖可使虾过敏原蛋白活性下降约10%。吴海明等[20]对木瓜蛋白酶水解南美白对虾蛋白进行了研究，发现过敏原消减的最佳条件为酶底比1:100，底物浓度3g/100mL，pH6.5，温度60℃，与过敏人血清反应的OD492为0.054。到目前为止，已有关于高压法消减大米中过敏原的报道[21]，但是国内外还没有利用高压结合酶消减虾过敏原的的研究，本研究将南美白对虾中水溶性蛋白，利用超高压法、超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解、超高压下直接酶解对虾过敏原进行消减，并且处理后的蛋白没有以往酶解所产生的苦味，为海虾脱敏的深入研究提供了一定依据。

4 结 论

对提取的南美白对虾蛋白过敏原，采用超高压法、超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解、超高压下直接酶解等方法均有消减作用。采用超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解，以及超高压下直接酶解，对消减效果更好。

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Elimination of Allergens from Litopenaeus vannamei by Ultra High Pressure Treatment Combined with Enzymolysis

XIE Dan-dan，HU Zhi-he*，XUE Lu，ZHANG Bo-yang，SU Wen-jing，FANG Yuan
(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Three methods, ultra high pressure (UHP) treatment, UHP treatment followed by papain hydrolysis and concurrent UHP treatment and papain hydrolysis, were developed for eliminating allergens in water soluble protein extracted from Litopenaeus vannamei. One-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize the operating conditions.The effectiveness of the methods was examined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The optimal UHP treatment was performed under 150 MPa and for 35 min at 45 ℃ when used alone, and the OD492 nm of antigen-antibody reaction was 0.1997. When used before papain hydrolysis, the optimal UHP treatment was performed under 350 MPa for 20 min at 45 ℃,and the OD492 nm of antigen-antibody reaction was 0.0492. When used concurrently with papain hydrolysis, the optimal UHP treatment was performed under 300 MPa for 35 min at 45 ℃, and the OD492 nm of antigen-antibody reaction was 0.05. These results demonstrate that UHP treatment followed by papain hydrolysis and their concurrent action were more effective in eliminating allergens in Litopenaeus vannamei. Therefore UHP has eliminating effect on allergens in Litopenaeus vannamei.

Litopenaeus vannamei；UHP treatment combined with enzymolysis；allergen elimination；ELISA

TS201.6

A

1002-6630(2012)08-0109-06

2011-10-26

谢丹丹(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：xddhjj03090512@163.com

*通信作者：胡志和(1962—)，男，教授，硕士，研究方向为专用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn