响应面法优化丰年虫卵壳脱乙酰度壳聚糖提取工艺

黄晓燕，张建新*，王 欣，彭鑫华，聂 路

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

响应面法优化丰年虫卵壳脱乙酰度壳聚糖提取工艺

黄晓燕，张建新*，王 欣，彭鑫华，聂 路

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

以丰年虫卵壳制备的甲壳素为原料，通过单因素试验和响应面设计法，确定丰年虫卵壳壳聚糖微波辅助提取技术的最佳工艺条件为微波时间33.4min、乙醇浸泡时间86min、碱液质量分数57.27%。按此工艺条件提取可获得脱乙酰度为84.12%的丰年虫壳聚糖。

壳聚糖；丰年虫；响应面；微波；脱乙酰度

丰年虫(Chirocephalus diaphanous)，又名仙女虾(fairy shrimp)，主要存在于海水及盐湖水中[1]。对丰年虫研究表明其营养价值丰富[2-3]，且卵壳中含有丰富的甲壳素，但是对其卵壳的利用不是很充分。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，比较甲壳素，溶解性更好，应用范围更广。壳聚糖及其衍生物具有减肥、去脂、抗菌、增强免疫、降低血压等作用[4-7]，因此壳聚糖在食品、医药、化妆品等领域具有重要的应用价值。微波法具有降能耗，减污染，省时间和原料等优势[8-11]。本实验在碱液和有机溶剂结合条件下，同时进行微波辅助分段处理，使得甲壳素充分脱乙酰基，制备较高脱乙酰度[12]壳聚糖，通过响应曲面法设计试验，探求微波提取脱乙酰度较高的壳聚糖的最佳工艺条件，为丰年虫卵壳的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丰年虫卵壳 陕西丰源生物科技有限公司；丰年虫甲壳素 实验室自制；N-乙酰-D-氨基葡萄糖(含量＞99%) 沃尔森生物技术有限公司；95%乙醇、NaOH、HCl、冰醋酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

P70D20T-J-D3型微波炉 格兰仕微波炉电器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；KDC-40型低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；FA2004型分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；101-Z型电热鼓风干燥箱 北京科伟永兴仪器有限公司；UV-2550型紫外分光光度计日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 丰年虫卵壳壳聚糖生产工艺流程

丰年虫甲壳素→乙醇浸泡→加入NaOH溶液后微波一段时间→离心→滤渣洗至中性→体积分数10% HAc溶液搅拌1h →过滤→滤液中加入质量分数10%氢氧化钠溶液调至中性使壳聚糖析出→离心，沉淀洗至中性→干燥→壳聚糖纯品

1.3.2 壳聚糖脱乙酰度的测定

采用紫外光谱法测定脱乙酰度，具体操作方法参见文献[13]。

1.3.3 单因素试验设计

取2g丰年虫甲壳素放于150mL三角瓶中，按照1.3.1节工艺脱乙酰制备壳聚糖。选取乙醇浸泡时间、NaOH质量分数、微波提取时间、微波功率为试验因素，以脱乙酰度为试验指标进行单因素试验(基本条件为乙醇浸泡时间1h、NaOH质量分数50%、微波提取时间20min、微波功率462W)。

1.3.4 响应面试验设计

依据单因素试验的结果，采用中心组合试验设计，以脱乙酰度为响应值，对微波提取时间、乙醇浸泡时间、NaOH质量分数进一步优化，因素水平见表1。

表1 中心组合试验因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite design

2 结果与分析

2.1 不同因素对壳聚糖脱乙酰度的影响

2.1.1 乙醇浸泡时间

图1 乙醇浸泡时间对壳聚糖脱乙酰度的影响Fig.1 Effect of ethanol soaking time on deacetylation degree of chitosan

由图1可知，随着乙醇浸泡时间的延长，甲壳素晶体束渐渐打开有利于碱渗入到甲壳素的内部，与乙酰基发生反应，产物的脱乙酰度值随之变大，在1.5h时达到最大，再延长浸泡时间脱乙酰度值变化不大。试验选择乙醇浸泡时间为1.5h。

2.1.2 NaOH质量分数

图2 NaOH质量分数对壳聚糖脱乙酰度的影响Fig.2 Effect of NaOH mass fraction on deacetylation degree of chitosan

由图2可知，随着碱液质量分数的增大，脱乙酰度值逐渐升高，55%后上升不明显。这是由于在碱液介质中，OH－进攻酰氨基中的羰基，形成过渡态到C＝O双键打开，是一个可逆过程，而过渡态上乙酰基的离去是瞬间的[14]。碱液质量分数低时，脱乙酰基反应只在甲壳素表面进行，随着碱液质量分数增大，扩散到甲壳素内部的OH－增多，但也造成脱落的乙酰基增多而影响扩散，这个复杂的过程有待于深入研究。试验选择NaOH质量分数55%。

2.1.3 微波提取时间

图3 微波时间对壳聚糖脱乙酰度的影响Fig.3 Effect of microwave treatment time on deacetylation degree of chitosan

由图3可知，随着微波时间的延长，脱乙酰度值增大，到25min时达到最大，之后变化缓和。微波对甲壳素脱乙酰反应有一定的“非热效应”[15]，在加热的同时，破坏了甲壳素分子链中的氢键，促进分子链分散和NaOH溶液渗入。微波处理10min时，由于微波加热升温快，甲壳素表面出现结块，所以试验中采取二次分段微波，即每10min时停止微波，将三角瓶振荡至结块被打散，制得脱乙酰度高的壳聚糖。试验选择微波提取时间25min。

2.1.4 微波功率

由图4可知，脱乙酰度值的变化随着功率的增大而不断增大，理论上微波功率越大越好，但是在试验中，功率太大，升温太快而极易导致壳聚糖降解，故试验中选取462W为最佳微波功率。

图4 微波功率对壳聚糖脱乙酰度的影响Fig.4 Effect of microwave power on deacetylation degree of chitosan

2.2 微波辅助提取较高脱乙酰度壳聚糖工艺的响应面分析

2.2.1 模型的建立与显著性检验

表2 中心组合试验设计及结果Table 2 Central composite design scheme and results for response surface analysis

中心组合试验设计与结果见表2，应用Design Expert 7.0.0软件对各因素进行多元回归拟合分析，得回归方程：

表3 响应面试验结果方差分析Table 3 Analysis of variances for the experimental results of central composite design

中心组合试验方差分析结果见表3，对应F表值[16]可知，整体模型P值为0.0004＜0.0001，该二次方程模型达到极显著水平，可以应用于工艺条件的优化。失拟项P＝0.1627＞0.05，不显著，说明拟合程度良好，未知因素对试验结果干扰很小，说明该模型合适。各因素中NaOH质量分数影响极显著，乙醇浸泡时间影响显著，微波时间影响不显著，按照对脱乙酰度的影响排序：NaOH质量分数＞乙醇浸泡时间＞微波时间。模型的决定系数R2为0.8821，说明该模型满足88.21%的样品空间。因此可以用该模型方程来分析和预测不同提取条件下壳聚糖的脱乙酰度值的变化。

根据回归方程，做出响应曲面图(图5)。从图5a可以看出，当NaOH质量分数一定时，在乙醇浸泡时间与微波时间的交互作用下存在一个脱乙酰度的最大值。当乙醇浸泡时间小于1.5h时，随着微波时间的延长，壳聚糖脱乙酰度逐渐延长；当乙醇浸泡时间接近于最大值时，随着微波时间的延长，壳聚糖脱乙酰度平缓的变化且有所下降，因为到反应后期脱下来的乙酰基会阻碍甲壳素颗粒外部脱乙酰的速率。当微波时间一定时，脱乙酰度随着乙醇浸泡时间的延长先升高后又降低，在大于1.92h时变化平缓，因为后来随着乙醇的挥发会导致一部分甲壳素的氢键重新结合，使得碱液作用受阻，影响脱乙酰程度。

图5 各两因素交互作用对壳聚糖脱乙酰度影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the effects of pairwise interactions among different factors on deacetylation degree of chitosan

从图5b可以看出，当乙醇浸泡时间一定时，NaOH质量分数与微波时间的交互作用对脱乙酰度的影响。微波时间趋于最小值时，随着NaOH质量分数的增加，脱乙酰度呈现上升趋势，且大于55%之后变化趋势平缓；微波时间趋于最大值时，随着NaOH质量分数的增加，脱乙酰度呈现先上升后平缓下降趋势，在55%达到最大值。NaOH质量分数在一定范围内，壳聚糖的脱乙酰度在随微波时间的延长而提高；当NaOH质量分数大于59.21%时，随微波时间的延长，壳聚糖的脱乙酰度逐渐趋于平缓，变化不明显，影响不显著。因为进入甲壳素的OH－是有限的，随着微波时间延长，导致脱落下来的乙酰基内外积累，影响反应的进行。

从图5c可以看出，当NaOH质量分数一定时，壳聚糖的脱乙酰度随着乙醇浸泡时间的升高，当浸泡时间大于1.5h时，增加趋于平缓。而当乙醇浸泡时间趋于最小值时，脱乙酰度随着NaOH质量分数增大而逐渐增加，即NaOH质量分数越大，较优的乙醇浸泡时间是越短的；当乙醇浸泡时间趋于最大值时，脱乙酰度随着NaOH质量分数增大而平缓降低。因为乙醇的挥发导致部分打破的氢键重新结合，不利于碱液作用，导致脱乙酰程度下降。

2.2.2 最佳工艺条件的确定与验证实验

通过Design Expert 7.0.0软件在自变量范围为[－1.682,1.682]内，进行二次回归模型的预测，得到2个最佳条件的方案，结合实际情况，选取微波辅助提取高脱乙酰度的壳聚糖的最佳工艺条件为微波提取时间33.41min、乙醇浸泡时间1.44h、碱液质量分数57.27%，预测响应值脱乙酰度为84.97%。考虑操作的方便性，将提取工艺参数修正为微波提取时间33.4min、乙醇浸泡时间86min、碱液质量分数57.27%，进行验证实验，分段微波处理，实际测得的脱乙酰度值84.12%，与理论值的偏差约为1.0%，说明响应面法所得优化提取工艺参数准确可靠。

3 结 论

在提取壳聚糖的过程中，各因素脱乙酰度的影响排序为：NaOH质量分数＞乙醇浸泡时间＞微波时间。通过单因素试验和应用响应面分析法优化微波提取较高脱乙酰度壳聚糖的工艺，得出最佳工艺条件为微波时间33.4min、乙醇浸泡时间86min、碱液质量分数57.27%，在最适提取条件下脱乙酰度值可达到84.12%。并得到壳聚糖的脱乙酰度与各因素变量的二次方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，经检验证明该模型合理可靠，有一定实际应用价值。

[1] 谢红民, 刁治民, 邓君, 等. 青海卤虫资源现状、开发利用及可持续发展[J]. 四川理工学院学报: 自然科学版, 2006, 19(1): 93-96.

[2] 吕志华, 于广利. 卤虫卵壳营养成分分析[J]. 水产科学, 2004, 23(1): 42-43.

[3] 潘茜, 叶金云, 陈建明. 南京丰年虫成虫、卵的生化分析与营养价值的研究[J]. 水产养殖, 2004, 25(1): 41-43.

[4] NO H K, MEYERS S P, PRINYAWIWATKUL W, et al. Applications of chitosan for improvement of quality and shelf life of foods: a review[J].Journal of Food Science, 2007, 72(5): 87-90.

[5] 杨靖亚, 吴忠宏, 于有军, 等. 羧甲基壳聚糖抗肿瘤及免疫增强活性研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2007, 12(12): 1391-1394.

[6] JEON Y J, SHAHIDI F, KIM S K. Preparation of chitin and chitosan chitooligosacchrides and their applications in physiological functional foods[J]. Food Reviews International, 2000, 16(2): 159-176.

[7] SHAHIDI F, ARACHCHI J K V, JEON Y J. Food applications of chitin and chitosans[J]. Trends in Food Science and Technology, 1999(10): 37-51.

[8] 胡宗智, 邹隽, 付建科, 等. 微波技术在壳聚糖制备中的应用研究进展[J]. 化学工程师, 2007, 136(1): 46-48.

[9] 薛志欣, 杨桂朋. 壳聚糖的提取及其脱乙酰化研究[J]. 鲁东大学学报: 自然科学版, 2006, 22(3): 208-210.

[10] 郝红英, 徐文国, 邵自强. 微波法制备羧甲基壳聚糖及其在水处理中的应用[J]. 高分子材料科学与工程, 2006, 22(2): 223-226.

[11] LERTWATTANASERI T, ICHIKAWA N, MIZOGUCHI T, et al.Microwave technique for efficient deacetylation of chitin nanowhiskers to a chitosan nanoscaffold[J]. Carbohydrate Research, 2009, 344(3): 331-335.

[12] De ALVARENGA E S, de OLIVEIRA C P, BELLATO C R. An approach to understanding the deacetylation degree of chitosan[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80(4): 1155-1160.

[13] 蒋挺大. 甲壳素[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003: 271.

[14] 张立彦, 曾庆孝, 林王旬, 等. 微波对甲壳素脱乙酰反应的影响[J].食品与生物技术, 2002, 21(1): 16-18.

[15] 张子涛, 陈东辉, 陈亮. 甲壳素脱乙酰化及其动力学模型研究[J]. 化学世界, 2004, 45(10): 511-514; 510.

[16] 王钦德, 杨坚. 食品试验设计与统计分析[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2005: 466.

Optimization of Extraction Process for Highly Deacetylated Chitosan from Chirocephalus diaphanous Eggshell by Response Surface Methodology

HUANG Xiao-yan，ZHANG Jian-xin*，WANG Xin，PENG Xin-hua，NIE Lu
(College of Food Science and Engineering, Northwest A＆F University, Yangling 712100, China)

One-factor-at-a-time method and response surface methodology were used to optimize the microwave-assisted extraction of highly deacetylated chitosan from Chirocephalus diaphanous eggshell. The optimal extraction conditions for achieving maximum degree of deacetylation of chitosan were as follows: microwave treatment time 33.4 min, ethanol soaking time 86 min, NaOH concentration 57.27%. Under these conditions, chitosan with a degree of deacetylation of 84.12% was obtained from Chirocephalus diaphanous eggshell.

chitosan；Chirocephalus diaphanous；response surface methodology；microwave；degree of deacetylation

TS245.9

A

1002-6630(2012)08-0085-04

2011-03-24

国家级大学生创新项目(2010A19)

黄晓燕(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。E-mail：hxy4302040@163.com

*通信作者：张建新(1959—)，男，教授，硕士，研究方向为食品营养安全与标准化。E-mail：zhangjx59@foxmail.com