二次正交旋转组合设计优化药桑花青素提取工艺

杨 松，周蓓蓓，程江华，邬德轩，丁之恩,*，闫晓明,*

(1.安徽农业大学茶与食品学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽 合肥 230031)

二次正交旋转组合设计优化药桑花青素提取工艺

杨 松1,2，周蓓蓓2，程江华2，邬德轩1，丁之恩1,*，闫晓明2,*

(1.安徽农业大学茶与食品学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽 合肥 230031)

在超声波辅助条件下，采用四元二次正交旋转组合设计研究乙醇体积分数、液料比、时间、温度4个因素对药桑花青素提取效率的影响，用DPS7.05软件分析得出4个因素的回归方程。结果表明，超声波辅助提取最佳工艺条件为：乙醇体积分数范围52.46%～55.93%、提取液料比范围39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取时间范围27.77～32.23min、提取温度范围50.18～52.4℃，在此工艺条件下花青素提取效率均能达到67%以上。

药桑；花青素；正交旋转组合设计；提取；优化

新疆药桑属于半栽种的野生桑资源，药桑在植物学分类上属桑科，桑属，黑桑种(Morus nigra Linn.)，新疆药桑是我国唯一的黑桑种，也是一种在自然界极其罕见的具有22组染色体的22倍体桑树种质资源[1-2]。药桑作为珍稀的药食兼用桑属品种资源，近年来引起了国内外桑树学科以及药学、营养学专家的广泛关注，开展了对药桑生物活性成分及药理作用的相关研究[3-5]。

合成色素稳定性高，着色力强且成本低廉，但随着研究的深入，发现很多曾允许使用的人工合成食用色素对人体造成程度不一的损害。而天然色素具有安全、无毒、资源丰富的优点，并具有一定营养和药理作用，故天然色素市场日益扩大[6]。花青素是天然色素中应用极其广泛的一类色素，属于多酚类化合物。花青素不但色泽鲜亮，还具有很强的抗氧化活性，能够减少冠心病、癌症和脑血管疾病的发病机率[7-9]。因此，优化花青素提取工艺，对花青素产品的开发具有重要的意义。

二次正交旋转组合设计是正交回归试验设计的一种，它既能分析各处理因子的影响，又能建立定量的数学模型，属更高级的试验设计技术[10-11]。

本研究在对6个提取条件进行单因素考察基础上，采用二次正交旋转设计法优化花青素提取工艺参数，提高花青素提取率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑椹：新疆药桑品种，新疆维吾尔自治区和田蚕桑科学研究所提供。

无水乙醇、浓盐酸、氯化钾、醋酸钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SP-75紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FS-450超声波处理器 上海生析超声仪器有限公司；真空干燥箱 上海实验仪器总厂；DFT-100多功能中药粉碎机 温岭市大德中药机械有限公司；FA2104电子天平 海民桥精密科学仪器有限公司；FD-1CE真空冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹花青素提取流程

1.3.2 桑椹花青素含量测定及提取率计算[12-15]

桑椹干粉中花青素含量的测定：精确称取2.000g桑椹干粉，置于锥形瓶中，加入80mL酸性乙醇在超声波辅助条件下提取，重复提取数次，直至提取液无色，提取液按pH示差法测定桑椹干粉花青素含量。

pH示差法操作如下：准确移取2份1mL待测提取液分别置于10mL离心管中，再分别加入8mL pH1.0和pH4.5的缓冲液于离心管中。达平衡后，分别在520nm和700nm波长处测定吸光度。花青素含量计算公式如下：

式中：ΔA为吸光度差，ΔA＝(A520nm,pH1.0－A700nm,pH1.0)－(A520nm,pH4.5－A700nm,pH4.5)；ε为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数，26900(L/(mol·cm))；DF为稀释倍数；MW为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2g/moL；L为光程，1c m。

1.3.3 单因素试验

精确称取1.000g桑椹干粉，加入一定体积的提取试剂。按不同的试验设计条件提取花青素，对提取溶液、提取液体积分数、提取温度、提取时间、提取液料比和超声波功率进行单因素试验，重复3次，取平均值。

1.3.4 二次正交旋转试验设计

在单因素试验基础上，选择合适的单因素，设计4因素4水平的二次正交旋转试验，以提取率为考察指标，确定最优提取工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取试剂对花青素提取率的影响

图1 提取试剂对提取率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent type on extraction efficiency

在提取温度50℃、提取时间30min、液料比30:1(mL/g)、超声波功率300W条件下，不同提取试剂对提取率的影响。如图1所示，酸性乙醇的提取效果最好。花青素属于黄酮类物质，根据“相似相溶”原理，可溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，并且在与其极性最相近的溶液中溶解性最好。此外，花青素在弱酸性条件下性质稳定，结构不易发生改变，而在中性和弱碱性条件下性质相对不稳定。因此，本实验以酸性乙醇作为提取溶剂。

2.1.2 乙醇体积分数对花青素提取率的影响

图2 乙醇体积分数对花青素提取率的影响Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction efficiency

在酸性乙醇为提取试剂(其他条件如2.1.1节)下，不同体积分数乙醇对提取率的影响如由图2所示，提取率随着酸性乙醇体积分数的增大先不断增高至最高点后降低。当酸性乙醇体积分数为50%时，提取率最大。乙醇浸提使花青素溶入乙醇溶液，乙醇溶液的极性随着乙醇体积分数的升高而变小，当溶剂极性和花青素极性最相近时，花青素在溶剂中溶解性最好，则花青素提取率最高。

2.1.3 提取温度对花青素提取率的影响

图3 提取温度对花青素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

图3表示不同温度对花青素提取率的影响(50%酸性乙醇为提取试剂，其他条件如2.1.1节)。由图3可知，温度较低时，桑椹花青素提取率随着提取温度的升高而增长。当提取温度为50℃时，提取率最大。但是继续升高温度后提取率反而下降，这可能与花色苷物质耐热性较差，在高温下易发生结构发生变化而褪色有关。因此过高的温度(＞50℃)会对桑椹花青素的色价及稳定性有造成一定影响。而低温条件(＜50℃)下提取率较低，造成资源的浪费。

2.1.4 超声波功率对花青素提取率的影响

图4 超声波功率对提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency

图4表示不同超声波功率对花青素提取率的影响(50%酸性乙醇为提取试剂，其他条件如2.1.1节)。由图4可知，超声波功率在100～500W时，花青素提取率随着超声波功率的提高而提高。当超声波功率达到300W时，继续提高超声波功率，提取率无显著增长。超声波的提取机理主要是超声波在提取溶液中产生的“空化效应”和机械作用：超声波一方面可有效地破碎桑椹的细胞壁，使花青素呈游离状态并溶入乙醇中，另一方面可加速乙醇的分子运动，使乙醇和花青素中快速接触，相互溶合、混合。当超声波功率较低时，破碎力度不够，使得花青素不能快速的融入乙醇中，所以提取率较低。但超声波功率过高时，环境噪音过大，且提取率没有显著提高，因此，考虑节能环保等因素，故选用300W作为提取功率。

2.1.5 提取时间对花青素提取率的影响

图5 提取时间对提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

图5表示不同的提取时间对花青素提取率的影响(50%酸性乙醇为提取试剂，其他条件如2.1.1节)。从图5可见，提取时间在10～50min时，花青素提取率随着提取时间的延长先提高后降低。当提取时间为20min时，提取率最大。提取时间为10min时，由于提取时间较短导致桑椹细胞中花青素无法得到完全的释放，使得提取效果不理想。但是当提取时间超过30min时，由于提取时间过长，导致花青素的结构可能受到超声作用的破坏而使提取率下降。

2.1.6 液料比对花青素提取率的影响

图6 液料比对花青素提取率的影响Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency

图6表示在不同的液料比对花青素提取率的影响(50%酸性乙醇为提取试剂，其他条件如2.1.1节)。由图6可见，液料比在10:1～30:1(mL/g)时，花青素提取率随着液料比的增加而提高，这与提取液料比过低，桑椹中花青素无法被乙醇溶液完全浸提出来有关。在液料比达到30:1(mL/g)后，花青素提取效率无显著升高。因此选定30:1(mL/g)为最佳液料比。

2.2 二次正交旋转试验

2.2.1 二次正交旋转试验设计与结果

表1 二次正交旋转试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal rotation combination design

表2 药桑花青素提取二次正交旋转组合设计试验方案及结果Table 2 Orthogonal rotation combination design scheme and results

根据单因素试验结果，以花青素提取液中花青素含量为考察目标，设计4因素4水平的二次正交旋转试验。确定提乙醇体积分数(X1)、提取液料比(X2)、提取时间(X3)、提取温度(X4)的零水平分别为50%、30:1(mL/g)、30min、50℃，试验设计及结果见表1、2。

2.2.2 回归模型建立与检验

采用DPS数据处理系统对表2中的结果进行二次多项式逐步回归分析，得到花青素提取效率(Y)和乙醇体积分数、提取液料比、提取时间和提取温度的回归模型：

表3 试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of the experimental results of orthogonal rotation combination design

由表3可见，回归方程的矢拟性检验F1＝0.79616＜F0.05(10,11)＝ 2.85 及 F0.01(10,11)＝ 4.54，F2＝ 6.17132 ＞F0.01(14,21)＝3.07及F0.05(14,21)＝2.20，说明模型的预测准确，模型成立，可用于描述花青素提取效率随提取液料比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数变化的规律。

在α＝0.05显著水平上剔除不显著项后，简化的回归方程：

2.2.3 主效应分析

P值即概率，反映某一事件发生的可能性大小。各因素的P值可以反映出各因素对试验指标的重要性，P值越小，表明该因素对试验结果影响越大，即重要性越大[16]。由表3可见，4个试验因素对花青素提取率影响大小依次为提取液料比＞提取温度＞乙醇体积分数＞提取时间。

2.2.4 单因素效应分析

将得到的回归方程中的四个因素任意三个固定在零水平，得：

把4个因子的取值固定在－2、－1.6、－1.2、－0.8、－0.4、0、0.4、0.8、1.2、1.6、2水平，根据上述方程，计算出各因子在11个不同水平上花青素提取效率(Y)，并以此作图，结果见图7。

图7 各单因素与花青素提取效率的关系Fig.7 Relationship between each variable and extraction efficiency of anthocyanidin

由图7可见，在各因子处于－2～2这一水平区间时，提取液料比与花青素提取率的关系最接近线性条件，表明提取液料比对花青素提取效率的影响最显著，另外提取液料比的升高有利于花青素提取率的增大。而乙醇体积分数、提取时间和提取温度与花青素提取率的关系曲线呈抛物线状，表明这3个因素不能无限制的升高，超过一定范围便会使花青素提取率降低。尤其是提取温度的升高会显著降低花青素提取率。此外，图7中各因素变化趋势与前面单因素试验结果基本吻合。

2.2.5 提取参数优化

为了得出最佳的提取参数，通常对试验数据进行频数分析。选取了提取效率大于67%的155个方案进行频数分析，得到95%的置信区间，如表4所示。

由表4可知，花青素提取最佳工艺参数范围为：乙醇体积分数52.46%～55.93%、提取液料比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取时间27.77～32.23min、提取温度50.18～52.4℃，在此参数范围内，花青素提取效率均大于67%。

表4 各变量取值频率分布Table 4 Probability distribution of each variable

2.2.6 验证实验

从优化提取参数范围内随机选择3个组合进行验证实验，结果见表5。

表5 验证实验结果Table 5 Results of validation experiments

由表5可见，3次验证实验平均理论值为71.66%，平均实际值为71.18%，两者仅相差0.48%，可见实际值与理论值基本吻合，且均在67%以上。由此可知，采用本实验的工艺参数，可获得67%以上的花青素提取效率。

3 结 论

根据二次正交旋转试验结果发现，花青素提取效率影响大小的因素依次为提取料液比＞提取温度＞乙醇体积分数＞提取时间，且花青素提取最佳工艺参数范围为乙醇体积分数52.46%～55.93%、提取料液比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取时间27.77～32.23min、提取温度50.18～52.4℃，在此参数范围内，花青素提取效率均大于67%。最后进行验证实验，结果与预测值基本吻合。因此本研究为提取桑椹花青素提供了较好的提取方案。

[1] 买买提依明. 新疆药桑的研究[J]. 北方蚕业, 2007, 28(1):1-3.

[2] 新疆蚕学会. 新疆桑树品种志[M]. 乌鲁木齐: 新疆维吾尔自治区农业厅, 1980: 3-7.

[3] 买买提依明, 卢红, 木合达尔. 新疆药桑有效成分测定及药理作用的研究初报[J]. 北方蚕业, 2006, 27(4): 16-18.

[4] 宋大可, 买买提依明, 乃比江. 新疆药桑果汁化学成分及药物价值的探讨[J]. 蚕桑通报, 1994, 25(4): 23-34.

[5] 买买提依明, 徐立, 武春, 等. 新疆药桑黄酮和多酚的提取与分析研究初探[J]. 北方蚕业, 2008, 29(4):12-14.

[6] BOLIVAR A C, LUIS C Z. Stability of anthocyanin-based aqueous extracts of Andeam purple corn and red-fleshed sweet potato compared to synthetic and natural colorants[J]. Food Chemistry, 2004, 86(1):69-77.

[7] WANG Weidong, XU Shiying. Degradation kinetics of anthoeyanins in blackberry juice and concentrate[J]. Journal of food engineering, 2007,82(3): 271-275.

[8] 吕英华, 苏平, 那宇. 桑椹色素体外抗氧化能力研究[J]. 浙江大学学报: 农业与生命科学版, 2007, 33(1): 102-107.

[9] AYSEGUL K, MEHMET O, BEKIR C. Stability of black carrot anthocyanins in various fruit juices and nectars[J]. Food Chemistry, 2006, 97(4): 598-605.

[10] 唐启义, 冯光明. 实用统计分析及其计算机处理平台[M]. 北京: 中国农业出版社, 1997: 77-91.

[11] 徐位力, 罗焕亮, 范恩友, 等. 二次正交旋转组合设计对马占相思组培增殖培养基的优化[J]. 广西植物, 2002, 22(6): 517-520.

[12] CORRALES M, TOEPFL S, BUTSZ P, et al. Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics, high hydrostatic pressure or pulsed electric fields: a comparison[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2008, 9(1): 85-91.

[13] 冯建光, 谷文英. 葡萄皮红色素的示差法测定[J]. 食品工业科技,2002, 22(9): 85-87.

[14] 杨兆艳. pH示差法测定桑椹红色素中花青素含量的研究[J]. 食品科技, 2007, 32(4): 201-203.

[15] 刘仁道, 张猛, 李新贤. 草莓和蓝莓果实花青素提取及定量方法的比较[J]. 园艺学报, 2008, 35(5): 655-660.

[16] 邓红, 仇农学, 孙俊, 等. 超声波辅助提取文冠果籽油的工艺条件优化[J]. 农业工程学报, 2007, 23(11): 249-254.

Optimization of Anthocyanidin Extraction from Black Mulberry (Morus nigra L.) by Quadratic Orthogonal Rotation Combination Design

YANG Song1,2，ZHOU Bei-bei2，CHENG Jiang-hua2，WU De-xuan1，Ding Zhi-en1,*，YAN Xiao-ming2,*
(1. College of Tea and Food, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；
2. Institute of Agro-food Science and Technology, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)

A quadratic orthogonal rotation combination design was used to explore the effects of ethanol concentration,material-to-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on extraction rate of anthocyanidin from black mulberry(Morus nigra L.) by ultrasonic-assisted extraction. A regression equation was established using DPS7.05 software. The optimal extraction conditions were found to be 52.46%－55.93% ethanol as extraction solvent at a liquid-to-material ratio of 39.51:1－42.43:1 (mL/g) for 27.77－32.23 min of extraction at 50.18－52.4 ℃. Under these conditions, the extraction rate of anthocyanidin was more than 67%.

black mulberry；anthocyanidin；orthogonal rotation combination design；extraction；optimization

TS202.3

A

1002-6630(2012)08-0033-06

2011-11-11

安徽省科技厅项目(100807030300)；安徽省财政厅项目

杨松(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：ys985826@163.com

*通信作者：丁之恩(1954—)，男，教授，博士，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：dingze78@ahau.edu.cn

闫晓明(1963—)，男，研究员，本科，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：582511625@qq.com