阳离子聚合物作为基因载体的研究进展

汤谷平，范 辉，胡奇达

阳离子聚合物作为基因载体的研究进展

汤谷平，范 辉，胡奇达

(浙江大学化学生物学和药物化学研究所，浙江杭州310028)

随着对生物材料学、基因组学及药物学等研究的深入，阳离子聚合物材料在基因传递、药物释放的研究中发挥着越来越重要的作用，受到研究者广泛的关注和重视。文中就阳离子聚合物作为基因载体的特点、研究进展和趋势等作一概述。

阳离子;聚合物;遗传载体;基因;阳离子聚合物基因载体

现代医学研究证明，疾病的发生是一个极其复杂的过程。在这个过程中，基因的抑制、过度表达或突变都可导致疾病的发生。特别在肿瘤的治疗领域，基因治疗已成为攻克和治愈肿瘤最具希望和挑战的方法。基因治疗是将具有正常功能的或者治疗作用的基因，通过特定的方式导入靶细胞，从而达到治疗疾病的目的。在基因治疗的实施过程中，除了寻找有效的治疗基因外，还必须选择合适的基因载体及基因导入方法，使一定量的目的基因能够进入靶细胞进行安全、有效、可控且稳定的表达。目前，应用于基因治疗研究的载体主要分成两大类:病毒性载体和非病毒载体。

病毒具有天然嗜性，能够自然感染细胞，将它们携带的基因转移到宿主细胞中，因此转导效率比较高，目前基因疗法中很多都使用了病毒载体，并已进入临床试验阶段。现使用的病毒主要有逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、腺相关病毒等。近年来在病毒载体方面取得了重大进展，但由于病毒载体仍然存在生物安全性、靶向特异性不够、对某些细胞转导不完全、易诱导宿主免疫反应等诸多缺陷，制约了病毒基因载体的进一步发展［1］。非病毒基因载体在基因转染与表达的效率上没有病毒载体高，但他们具有独特的优势，如低毒性、低免疫原性、无传染性、合成制备方便、结构灵活可控［2］，已经得到研究者的广泛应用，其中阳离子聚合物是最主要的且研究最广泛的非病毒基因载体之一。

阳离子聚合物由于其结构中带正电荷，容易通过静电作用与带负电荷的核酸(DNA，RNA，PNA)形成复合物，核酸被压缩，避免了酶降解。由于复合物在适当条件下带有正的净电荷，有助于对细胞的附着和随后的内吞以及溶酶体逃逸过程。为了促进细胞内吞过程，可通过对阳离子聚合物进行修饰，利用受配体原理来促进受体介导的内吞。例如，叶酸、转铁蛋白等分子通过共价键接枝到阳离子聚合物，可促进核酸的选择性传递和内吞入靶细胞［3］。本课题组曾发表过阳离子聚合物的专题论述［4］，近年来阳离子聚合物的研究又有了许多突破性进展。目前常用的阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、壳聚糖(chitosan)、树枝状聚合物(dendrimer)等［5］，绝大部分的阳离子聚合物结构中都具有可质子化的胺基基团，不同的聚合物之间数量各异。

1 阳离子聚合物

1.1 聚乙烯亚胺(polyethyleminine，PEI) 聚乙烯亚胺是目前研究最广泛的阳离子聚合物非病毒基因载体，它是由单体(-CH2-CH2-NH-)构成的具有伯胺、仲胺和叔胺基团的水溶性聚合物。PEI单体中每3个原子含1个氮，并构成不同的胺基。这些胺基的pKa值不同，使PEI在较宽的pH范围均可以被质子化，这是PEI有较强的结合DNA和黏附细胞并作为基因转导载体的重要原因。也正是因为PEI在广泛的pH范围内具有吸收质子的能力，即质子海绵效应，使PEI/DNA复合物被内吞进入细胞后，能在内涵体(endosome)的酸性环境中吸收H+，使渗透压增高，导致膜不稳定甚至破裂，从而使被吞噬的复合物逃逸出来，避免DNA降解。从结构上看PEI有两种结构:直线型和支链型，其中支链型的PEI是一种高度分支的聚合物，较直线型具有更强的与DNA的静电相互作用，可以更大程度的压缩DNA，使纳米粒子变小及提高zeta电位。在性能上它具有强大的吸收H+的能力，可以引起内涵体的肿胀而导致膜破裂释放其中的DNA。研究发现，支链型PEI在特定细胞系中转染效率高于直线型PEI［6］。分子量是决定其转染效率重要因素，高分子量的PEI具有高效的基因转染效率，但因为其大量正电荷的存在以及非生物降解性，可以导致细胞膜去稳定化，显示出较大的细胞毒性，低分子量的PEI(低于2 kDa)毒性低，但基因转染效率也随之降低［7］。为此，许多研究者对小分子PEI进行结构修饰，开发了各种衍生物，取得了良好的效果。利用可降解的化学键，如二硫键、酯键、酰胺键或缩醛基等将低分子量的PEI连接起来，形成线形或多分枝状结构的高分子量PEI，由于这种衍生物中可生物降解性的化学键增多，使其在体内可生物降解成低毒或无毒的低分子量PEI，这样在具有较低细胞毒性的同时，具有较高转染活性。Peng等［8］以2步法制备了二硫键交联的聚乙酰亚胺(PEIX-SSY，X为PEI分子量，Y为硫化度。具有中等硫化度的交 联 的 PEI800-SSY(PEI800-SS2.6、PEI800-SS3.5，PEI800-SS4.5)在适当的N/P比例下可形成大小为200～300 nm聚合物纳米粒，硫化太低或太高(Y低于2.6或高于4.5)则形成大小为600 nm 左右更为疏松的纳米粒。PEIX-SS3.0-4.0在 X分别为800、1 800、25 000时，较宽范围的 N/P比下均可形成小于400 nm纳米粒。在HeLa、COS7、293T和CHO四种细胞上评价交联PEI作为基因载体体外转染pGL3的效率。发现二硫键含量和PEI分子量大小决定了转染效率。合适硫化度(2.6 ～4.5)和 PEI800-SSY系列，比25 kDa的PEI具有相对较低的细胞毒性和更高的基因转染效率。过低或过高硫化度的聚合物因未能形成紧凑的聚合物纳米粒，则转染效率较低。除了低分子量PEI自身偶联外，还可采用PEG、环糊精、壳聚糖、聚氨基酸、脂肪酸对PEI进行结构修饰，以获得低毒性、可降解、高稳定和高效转染的新载体［9，11］。黄宏亮等［9］将低分子量PEI 600与2-羟丙基-γ-环糊精(HP γ-CD)相交联形成新的共聚物，然后与对Her-2受体蛋白具有高亲和力的MC-10寡肽，在N/P比大于6时就能完全压缩质粒DNA。N/P比为40时复合物/DNA纳米粒粒子大小约为170～200nm，zeta电位约20mV。该载体显示出非常低的细胞毒性，提高了对Her-2阳性肿瘤细胞的靶向性，体内外均可高效地将报告基因传递至靶细胞中。在动物模型中使用该非病毒载体携带α-干扰素质粒，与25 kDa PEI比较具有更好的抗肿瘤效果，肿瘤生长受到了较为显著的抑制。李达等［10］以8臂的PEG为核心，与600 Da的 PEI串联成大分子量的聚合物EAPP，并在该聚合物上偶联靶向于肿瘤细胞表面纤维母细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)的MC11多肽后形成聚合物载体EAPPM。靶向配体修饰后的阳离子聚合物在N/P比为20的时候，可以完全缩合质粒DNA，形成约300 nm大小，表面电荷约为20 mV的纳米粒。在HepG2细胞中，转基因效率是比EAPP增加15倍，而在PC-3细胞中，则没有这种效率增加效应。荷瘤裸鼠经尾静脉注射后，EAPPM携带基因的表达是EAPP的4倍，25 kDa PEI的23倍。在PEI-CD上偶合FGFR的CY11多肽后，在表达 FGFR的 COS-7和HepG2细胞上显示出较强的转基因活性，在不表达FGFR的PC-3细胞上，则没有这种效果。PEG化也是有效的方法之一，动态光散射结果显示PEG化程度提高，可防止血清存在下阳离子聚合物纳米粒粒径的增加。研究显示PEG化普遍降低了PEI的基因转染效率，将2 kDa的PEG接枝到25 kDa PEI后发现，随着PEG取代聚合物比例的增加，其细胞毒性和pDNA结合能力均降低，但在合理的PEG取代与聚合物/pDNA比率下，PEG化是比PEI本身更有效的载体［11］。

1.2 聚赖氨酸(poly-l-lysine，PLL) 聚赖氨酸是由赖氨酸制备得到的一种具有氨基官能团、易水溶性、可生物降解和相容性的阳离子功能聚合物，其结构中伯胺基的质子化作用而带正电荷，通过静电作用可以与带负电的DNA结合。研究表明，低分子量聚赖氨酸(＜3 000)可质子化伯胺基数量较少，较难与DNA形成稳定的复合物，转染效率低;高分子质量聚赖氨酸的细胞毒性较大，且与DNA形成的复合物易聚集和沉淀，稳定性依赖于体系的离子强度［12］。因此，可考虑采用表面修饰或连接靶向性配体的方法提高转染效率、降低细胞毒性。Liu［13］最近报道了用mPEG-PLGA-b-PLL共聚物携带阿霉素和siRNA的释放体系，在体内实验中，所携带的Cy5-siRNA在huh-7肝癌动物模型中有高度的靶向表达。Halas［14］用聚赖氨酸-短肽聚合物包裹纳米金，制成NS-PLL复合物用于携带DNA和siRNA，在药物的释放中采用接近纳米金的共振波长进行激光照射，以控制药物的定位释放。Qiao［15］报道了用聚赖氨酸修饰纳米多孔硅胶(LP-MSN-PLL)，制成一种新型的基因释放体系，该输送体系的微粒粒径约为100～200 nm，并形成一个笼装结构物，其空腔内径为30 nm，入口直径约为10 nm，在用于释放模型基因DNA-Cy3表现出良好的性能。这些最新的研究工作为聚赖氨酸的研究提出了新的思路和方向。

1.3 壳聚糖(chitosan) 壳聚糖是一种天然的阳离子聚合物，其由葡糖胺单体通过(β-1，4)糖苷键连接而成，它生物相容性良好、细胞毒性低、可生物降解、无免疫原性，且具有抗菌、抗氧化活性和粘附特性等特点。壳聚糖的pKa值约在6.5左右，在pH值低于6.5时，壳聚糖带有的正电荷密度较大，它可通过静电吸引和氢键与带负电荷的DNA结合，保护DNA免受核酸酶的降解。

壳聚糖的分子量和脱乙酰度是影响壳聚糖/pDNA纳米粒包封效率的重要参数。Bozkir等［16］研究发现，pDNA包封效率与脱乙酰度成正比相关，与壳聚糖分子量成反比。以高脱乙酰度壳聚糖制备的pDNA/壳聚糖纳米粒分别具有92.7%、98%和90.4%的包封效率，可保护被包封的pDNA免受核酸酶降解。壳聚糖与DNA的N/P比对有效的基因转染至关重要，Thibault［17］等通过研究正电荷密度对转染的作用机制发现，加入过量的壳聚糖可以促进被细胞的摄取和复合物从内吞/溶酶体中的逃逸。Chen［18］等报道了用电镀法将壳聚糖/siRNA微粒涂布于PLGA纳米管上，在释放实验的50天中，所释放的siRNA未被降解。表明体系对siRNA具有保护作用，在基因沉默实验中，用弱碱对释放体系进行预处理，可以使50%基因得以沉默，远高于对照组。Tahara等［19］最新研究显示，用壳聚糖和聚山梨醇酯80与PLGA纳米微球可以制成细胞尺寸的巨型单层囊泡(Giant，unilamellar vesicles，GUV)，用于模拟细胞膜，以研究纳米微粒与细胞膜的相互作用。研究所发生的细胞囊泡内在化表明，载体材料的表面性质是微球进入细胞脂质膜的重要因素。多层包裹的组装技术也被引入壳聚糖载体材料，Han等［20］用过静电作用，将纳米金用壳聚糖包裹后先制成纳米金-壳聚糖核(AuNP-CS)，再将可逆电荷高分子材料PAH-Cit和聚乙烯亚胺(PEI)沉积于上述核微球上，形成层-层组装的PEI/pah-cIT/AuNP-CS核壳结构复合物，并将其携带 Cy5-siRNA在MCF-7细胞上进行基因沉默和耐药机理研究，表明输送体系具有保护siRNA，有效的细胞吞噬及溶酶体逃逸作用。Gao等［21］为提高壳聚糖基因转染效率，将聚乙烯亚胺(Mw=1.8 kDa)接枝到壳聚糖上合成了CP复合物，考察了其粒径、zeta电位、DNA结合能力、细胞毒性以及肿瘤细胞中基因转染效率。在HepG2、A549和HeLa细胞中，CP比PEI 25 kDa毒性更低，同时显示出比PEI 25 kDa高的转染效率。共聚焦激光扫描显微镜数据显示CP进入细胞核的时间是4h，比PEI 25 kDa长，但比壳聚糖短。当CP被用作基因载体将CCL22基因转入H22细胞中，当这些转基因细胞被接种小鼠时，肿瘤生长速率大幅度降低。

1.4 树枝状聚合物(dendrimer) 树枝状聚合物是近年应用较多的阳离子聚合物基因载体，具有独特的三维枝化对称结构，表面往往分布了大量氨基。其中聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM)是研究最为广泛的一类树枝状大分子聚合物。与其他阳离子聚合物相比，它具水溶性佳、毒性低等优点。在生理条件下，PAMAM树枝状聚合物末端胺基可以完全质子化而带正电荷，与带负电荷的核酸分子发生静电结合作用，形成具有高度稳定性的复合物，保护核酸避免核酸酶的降解，在体内或体外表现出较高转染效率。

利用氨基酸对PAMMA末端进行修饰，可以改变PAMAM表面的胺基基团数目，从而改变其正电性，也可改变PAMAM的疏水亲水特性，从而影响其细胞转染效率。Kumar等［22］制备并评估了鸟氨酸修饰的PAMAM G4树枝状聚合物，在N/P=10时具有较高的转染效率，且血清的存在并不影响基因转染效率。鸟氨酸过量时可降低经修饰的PAMAM G4树枝状纳米粒的转染效率，但对未经修饰的无影响。顾忠伟等［23］以精氨酸修饰 dendrimers制得dendrimer-Arg，随着转染时间延长和N/P比率的增加，在HEK-293细胞上转染效率提高，可显著抑制肿瘤细胞的增值。

PEG也是对PAMAM表面进行化学修饰的常用材料之一，它可以屏蔽部分表面正电荷，提高树枝状聚合物的体内活性及生物相容性，降低细胞毒性。Tang等［24］将 PAMAM G5和 G6树枝状聚合物中8%的表面胺基以PEG 5000进行修饰，进行了体外和小鼠肌肉注射的siRNA传递研究。PEG修饰的树枝状聚合物可保护siRNA免受RNA酶的消化，在血管平滑肌细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中有较高的转染效率。无论是在质粒介导(293A细胞)还是腺病毒介导(COS-7细胞)绿色荧光蛋白的表达，PEG修饰的聚合物纳米粒携带siRNA均可实现对其的有效敲除。对于腺病毒感染或绿色荧光蛋白转基因小鼠，利用PEG修饰的PAMAM肌注给予GFP-siRNA，也可显著抑制绿色荧光蛋白的体内表达。

2 阳离子聚合物作为药物和基因的共同载体

将药物和治疗基因一起加载于同一种阳离子聚合物时上，形成的阳离子聚合物纳米粒被内吞入细胞后，在缓慢释放药物同时也进行了治疗基因的表达。这样一方面通过给予特定的基因降低了化疗药物的剂量，减少其毒副作用，逆转化疗药物的多药耐药现象，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。另一方面由于化疗药物的使用可以促进基因在肿瘤细胞中的表达，激活死亡受体而触发细胞凋亡机制。两者联合使用可以相辅相成，互相促进，达到提高抗肿瘤效果的作用。

从化疗药物与治疗基因协同释放的概念提出，到目前的基础研究及临床应用，协同释放已经已取得了相当的进展，药物-siRNA、药物-基因蛋白以及药物-治疗基因等二元、三元组合等治疗模式运营而生。Zhu等［25］利用可逆加成断裂链转移聚合反应，合成了三种可生物降解的PDMAEMA-PCL-PDMAEMA三嵌段共聚物，其中所含PDMAEMA分子量分别为2 700、4 800和9 100。这三种共聚物在水中可形成带有+29.3到+35.5 mV的表面正电荷的纳米胶束，前两者显示出较低的毒性，凝胶阻滞试验显示在N/P比分别为4/1和2/1以上时能有效结合siRNA。与20 kDa PDMAEMA或25 kDa支链型PEI相比，第一种共聚物和GFP siRNA的复合物在GFP表达的MDA-MB-435-GFP细胞中，可显著增强基因沉默的效率，并且此胶束携带紫杉醇后作用于PC3细胞，可能由于细胞吸收的改善，显示出比游离紫杉醇更高的药效。联合VEGF siRNA和紫杉醇共同传输入肿瘤细胞，可明显敲除VEGF的表达。帅心涛课题组［26］将 PEI-PCL装载阿霉素后，结合 Bcl-2 siRNA，并将该纳米微粒表面以 FA-PEG-PGA进行修饰，该载体可将阿霉素及siRNA同时靶向导入C6细胞，有效抑制了肿瘤细胞上调表达抗凋亡基因，使C6细胞对阿霉素的敏感性显著提高。本课题组的胡奇达等［27］将小分子化疗药物替加氟结合于PEI-CD阳离子聚合物后，在N/P比为25的时候能与质粒DNA形成粒径为150nm左右的纳米粒，能同时将药物与基因有效地传递入B16F10细胞。同样将阿霉素接枝于PEI-CD后，携带p53基因，在MCF-7多药耐药乳腺癌细胞中显示出显著的肿瘤抑制作用，可明显延长荷瘤小鼠的生存期［28］。以PEI-CD为主体，连接阿霉素的金刚烷Ad-Dox或连接紫杉醇的金刚烷Ad-PTX为客体，形成基于主客体结构连接的自主装纳米材料PEI-CD/Ad-Dox、PEI-CD/Ad-PTX，可以与治疗基因形成超分子纳米微球，协同所携带的小分子化疗药物作用于肿瘤细胞［29-30］。

3 结语

目前有关阳离子聚合物应用于药物和基因给药体系的研究发展迅速，为药物与治疗基因的可控释放提供了一个平台，其发展前景是相当引人入胜的。当然以阳离子聚合物为基础的基因传递体系也同样存在一些潜在的问题。像如何提高阳离子聚合物的传递、表达基因的效率，更大程度地发挥抑制肿瘤细胞的作用;如何改善阳离子聚合物的生物降解性，降低其对机体的毒性，提高聚合物在生物相容性和安全性。再者，对于阳离子聚合物的基础研究与实际应用之间也存在一定的脱节，虽然许多聚合物的基础研究取得了长足的进展，但真正可应用于临床治疗的却很少。相信随着有机化学、高分子化学、分析化学、药剂学的发展和生物技术的不断进步，以及对体内细胞生物学特性和疾病机制了解的不断深入，将会有更多高生物活性、高安全性的阳离子聚合物材料应用于临床治疗中，为治愈更多的疾病，造福人类。

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R 730.54

A

1008-9292(2012)06-0593-06

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.06.001

国家自然科学基金资助项目(30970711，21074111).

2012-10-09

2012-10-22

汤谷平(1961-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物材料、药物控制释放和非病毒性基因药物载体研究;E-mail:tangguping@yahoo.com.cn

［责任编辑 张荣连］