热休克蛋白70在高脂血症大鼠肾脏中表达及意义

周 甄 徐汉江 张海洋 王倚天 黄大可 朱华庆 汪 渊 贾雪梅△

1（安徽医科大学 第一临床学院，合肥230032）

2（安徽医科大学 形态学中心实验室，合肥230032）

3（安徽医科大学 生化教研室，合肥230032）

高脂血症（hyperlipidemia）是指血浆总胆固醇（TC）和（或）甘油三酯（TG）的异常增高。特别是低密度脂蛋白（LDL）和胆固醇（TG）对血管内膜损伤，可导致动脉粥样硬化的发生（AS）［1］。大量流行病学调查证明［2］，大多数AS患者血中胆固醇水平比正常人高，而AS的严重程度随血浆胆固醇水平的升高而加重，随着现代经济生活水平的提高，AS的发病率和死亡率逐年升高，成为危害人类健康的严重因素。热休克蛋白（HSP）是细胞在受到热应激或其他应激源的刺激时能够高效表达的一类蛋白。近年来一些实验表明，高脂血症可成为肾病发生的病理机制之一［3］，而高脂血症和动脉粥样硬化的发生与热休克蛋白所引发的免疫应答之间有重要关联［4］。故本实验采用高脂饮食喂食大鼠模型，通过HE染色和免疫组化染色观察大鼠肾组织病理学改变和HSP70的表达。探究大鼠高脂血症模型肾组织损伤与HSP70表达水平的相关性并探讨HSP70表达在组织细胞中的作用和临床意义。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Nikon显微镜及图像分析系统；德国莱卡切片机；Ⅰ抗为鼠IgG 抗HSP70抗体（购自北京博奥森生物技术有限公司）；Ⅱ抗山羊抗兔通用二抗，辣根酶标记链酶卵白素工作液及DAB 试剂（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 动物模型的建立与分组

健康大鼠按体重编号，随机分为正常组和高脂血症组两组，每组各5只。正常组：室温及稳定适度条件下，全价颗粒饲料喂养。高脂血症组：高脂饲料成分：基础饲料含胆固醇1%，猪油5%。动物分只单独饲养，自由饮食与饮水。

1.3 标本的制备

实验第12周处死大鼠，眼眶取血检测各组鼠血脂水平，取出肾脏，用生理盐水冲洗然后吸干水分，l0%甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚4μm。

1.4 HE染色

切片脱蜡至水，入苏木精染色20 min，再进行分色、蓝化，入伊红染色2 min，脱水、透明和封片，观察结果。

1.5 免疫组化染色

切片脱蜡至水，将切片放入柠檬酸盐缓冲液中，微波炉抗原热修复后，加入去离子水H2O2（灭活内源性酶），再加入正常山羊血清封闭液。滴加1∶100比例稀释的一抗HSP70，4℃过夜后滴加二抗，后加入辣根酶标记链酶卵白素工作液，DAB 显色后，苏木精轻度复染，中性树脂封片并观察。阴性对照实验滴加PBS代替一抗，其余步骤做相同处理。

1.6 计算机图像分析与统计处理

应用计算机图像分析系统，将免疫组化染色的切片在光镜下统一放大10×40倍，每张切片上随机选取5个视野进行细胞着色的统计学分析，计算机测量阳性细胞的HSP70表达含量（以相对光密度值表示）。所有数据以均数±标准差（）表示，采用SPSS 13.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 血脂检测结果

取保存于－80℃的血清，检测各组TG，TC，HDL－C水平，其中检测工作由解放军105医院检验科完成。高脂血症组TG，TC，HDL－C 水平与正常组比较有显著增高（见表1）。

表1 大鼠血脂水平检测结果比较（，mmol／L）Table 1 Compare of the level of blood－fat in rats（，mmol／L）

表1 大鼠血脂水平检测结果比较（，mmol／L）Table 1 Compare of the level of blood－fat in rats（，mmol／L）

注：与正常组比较，＊P＜0.05

2.2 HE染色结果

正常组：肾小球结构正常，肾小管上皮细胞未见变性、肿胀。细胞排列整齐、完整。高脂血症组可见部分肾小管上皮细胞破碎，核固缩，胞浆轻微肿胀变性，细胞排列紊乱。肾小囊周围有少量炎性细胞浸润，肾小囊内细胞有空泡形成（见图1）。

2.3 免疫组化染色结果

正常组大鼠肾脏免疫组化结果为弱阳性，HSP70在肾小球中几乎无阳性细胞表达，肾小管有微量至中等阳性表达。高脂血症组大鼠肾小球中HSP70 有少量阳性细胞表达，肾小管上皮中有HSP70表达，为强阳性反应（见图2）。

2.4 计算机图像分析结果

正常组的HSP70 平均光密度值为0.1185±0.0078，高脂血症组平均光密度值为0.3106±0.0484。高脂血症组与正常组相比较，HSP70表达含量显著增多，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 大鼠肾组织内HSP70平均光密度值比较（）Table 2 Compare of the value of average optical density of HSP70of kedney in rats（，mmol／L）

表2 大鼠肾组织内HSP70平均光密度值比较（）Table 2 Compare of the value of average optical density of HSP70of kedney in rats（，mmol／L）

注：与正常组比较，＊P＜0.05

3 讨论

热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是指一组广泛存在于生物进化过程中高度保守的多肽蛋白，它在应激原特别是环境高温诱导下能够高效生成表达。全氨基酸序列分析发现该类蛋白具有80%以上的相似性。这种蛋白最初由Ritossa在研究果蝇的唾液腺多丝染色体中所发现并由后人于果蝇幼虫的唾液腺中分离［5］。除高温条件外，多种应激如缺血、缺氧、感染、重金属等都可诱导HSP的大量表达［6］。研究表明，HSP70在保护细胞时，其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关［7］。由此可见，热休克蛋白作为一种重要的保护蛋白，对维持机体的稳定性和环境适应性具有重要的生理意义。热休克蛋白不仅具有应激性，大部分的热休克蛋白还能以分子伴侣的形式参加机体内蛋白质的合成、折叠、修饰加工、运载和降解。Morimoto等［8］将主要的HSP分为HSP90、HSP70、HSP60及小HSP 等4个家族。其中，HSP70对应激条件最敏感，是具有重要应激保护作用的分子。近年来，科学界对HSP70的研究颇多且较深入，如有关肾间质细胞高渗透压引起的肾髓质HSP70的表达增高［9］，高脂引起的大鼠血浆内HSP70表达的研究［2］，以及热应激大白鼠脾脏和肝脏组织HSP70表达的研究［10］等。由于HSP70的应激效果明显，故大部分实验着重于其应激反应的研究。

本实验中高脂血症组的TG，TC，HDL－C 含量均明显高于正常组，提示造模成功；形态学结果显示，高脂血症组部分肾小管上皮细胞破碎，核固缩，胞浆轻微肿胀变性，细胞排列紊乱。肾小囊部分破坏，球内细胞部分坏死消失空泡化。与正常组对比显示，该模型组有较为严重的病理改变。而免疫组化结果显示：高脂血症组肾组织中HSP70的表达为强阳性，比正常组显著增多。研究发现：由高脂饮食引发的高脂血症使肾脏组织受损，其组织细胞肿胀变性，并出现不同程度的病变，其受损模型高表达HSP70，由此可见，HSP70的表达可作为机体组织损伤的抗应激保护机制，组织细胞受损能够引起HSP70的高效表达。高表达的HSP70提示肾脏受到损害并引起炎症反应诱发应激保护机制。王丽娜等［11，12］曾报道HSP70在肝癌组织细胞中呈强阳性表达，参与肿瘤细胞的增生与凋亡，与肝癌的发生发展、生物学行为以及预后都有着密切的关系。周成福等［5］也报道在大鼠急性脊髓损伤模型HSP70呈高表达。此外，童雨田等［13］有关于HSP70在兔动脉粥样硬化易损斑块内的高表达则进一步揭示了其过度表达时能够引起炎性反应。综上所述，HSP70在高脂血症肾脏组织损伤模型中可能的调控机制及生理意义为：①作为各种生物所共有的起应急保护的高度保守蛋白，HSP70在高脂血症肾损伤模型肾小管中高表达，而在肾小球中仅有微量表达，可以推断出高脂血症引起的肾损伤主要发生在肾小管。②高脂血症引起的肾脏组织损伤激活了HSP70的应急保护机制，使得HSP70 在肾脏组织细胞中高表达，通过HSP70 的表达程度来预测肾脏的损伤程度，使得热休克蛋白不仅成为衡量组织损伤程度的一个重要指标，肾脏中HSP70水平的显著提高也预示着高血脂症已经对肾脏产生了威胁，从而成为肾脏早期衰竭的预警标志物。③在肾组织修复损伤细胞的进程中，HSP70可作为炎症因子及抗原，介导多种应激刺激信号如IL－6和免疫细胞，以巨噬细胞为主，诱发炎性反应与免疫反应［13］。HSP70 已成为有效的抗细胞凋亡机制的中介［14］，因而HSP70高表达成为受损组织保护修复机制中不可或缺的重要环节之一。其具体机制尚待研究。因此HSP70的高表达为研究机体组织损伤程度和定位，以及的治疗方法提供了新思路，对临床上疾病的早期预防与治疗具有重要意义。

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