hTERT启动子引导hNIS基因重组腺病毒介导放射性核素的裸鼠显像

赵兴业，李 玮，谭 建，王 澎，李 宁

（天津医科大学总医院核医学科，天津300052）

报告基因指其表达产物非常容易被检测的基因。报告基因显像则是通过将报告基因转染给靶细胞后，通过检测报告基因从而显影的一种方法。现有的报告基因如荧光素酶、转铁蛋白、钠碘转运体（NIS）等，可以通过光学成像，核素显像，MRI等方法进行检测[1-2]。其中，NIS基因因为可将细胞外的碘转运进入细胞内，所以可以方便地进行放射性核素显像。在既往研究中已证明使用脂质体可在体外将NIS基因转入大细胞肺癌细胞内，用筛选后的肿瘤细胞构建荷瘤裸鼠模型，进行放射性核素显像[3]。但是，该研究存在脂质体不能进行体内转染的问题。为解决以上问题，构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS（hTERT启动子引导hNIS基因表达的Adeasy系统重组腺病毒），并利用该重组腺病毒能实现体内靶向hNIS基因表达的特点对端粒酶阳性胶质瘤U87荷瘤裸鼠进行体内转染及核素显像。恶性胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，虽然可以通过手术、放疗、化疗、抗肿瘤药物得到治疗，但是远期效果很差，致死率高，易发生转移[4-5]。将hNIS基因作为报告基因的核素显像技术应用于胶质瘤核素显像，开拓了靶向性核素显像的新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 U87细胞系由本实验室保存，并于37℃、5%CO2的培养箱中，使用含10%胎牛血清（fetalbovine serum,FBS）的达氏修正依氏培养液（Dulbecco’smodified Eagle’smedium,DMEM） 中培养。重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS等均由本实验室保存。BALB/c品系裸鼠购自中国医学科学院中国协和医科大学北京实验动物中心,饲养于天津医科大学实验动物中心。SPECT（Discovery VH）为美国GE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒的扩增 将U87细胞接种于25 cm2培养瓶中，培养24 h至细胞达到60%融合。取病毒液Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-EGFR感染U87细胞，待转染7~10 d后，收集细胞并反复冻融，12 000 r/min离心后收集病毒上清。如此反复数次后，扩增病毒至所需滴度，即5×109PFU。

1.2.2 测定转染后U87细胞摄碘率[6]将U87细胞在6孔板上培养至80%融合，Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-EGFR按50感染复数（multiplicity of infection,MOI）的病毒梯度来转染并孵育1 h后更换为10%FBS的新DMEM培养基，继续培养24 h后，进行摄碘率测定。将18.5 kBq125I/孔U87细胞孵育40min，使用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS）冲洗2遍后，使用γ计数器测定每孔细胞的每分钟放射性计数(countperminute,CPM)值。

1.2.3 Western blot检测hNIS蛋白表达 提取细胞总蛋白，然后采用10%十二烷基硫酸钠--聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluioride,PVDF）膜，5%脱脂牛奶4℃封闭过夜。选取Santa cruz公司的sc-48055为NIS基因一抗，美国Santa cruz的sc-2004为NIS基因二抗。然后加入ECL化学发光反应液（美国Thermo），室温1min。

1.2.4 胶质瘤荷瘤动物模型的构建 选取4周龄BALB/c雌性裸鼠每组4只，将1mL约5×106的U87胶质瘤细胞进行右肩胛皮下注射，当裸鼠皮下肿瘤长至直径10mm（约注射后3周），将重组腺病毒 Ad-hTERT-hNIS和 Ad-CMV-EGFR（5×109PFU/50μLPBS）分别进行裸鼠瘤内注射。U87细胞接种裸鼠同时开始封闭甲状腺，在裸鼠饮水中加入优甲乐（L-T4）5mg/L，持续至实验结束，以减少甲状腺摄碘量从而最大限度地增加转染肿瘤的摄碘率。

2 结果

2.1 测定U87细胞摄碘率 转染Ad-hTERT-hNIS的U87细胞系的摄125I活性为 10 569.3±203.2，转染Ad-CMV-EGFR的U87细胞系的摄125I活性为480.0±25.7。转染hNIS基因后的U87细胞摄碘能力较对照组提高约22倍左右（t=101.23，P<0.01），表明经重组腺病毒转染后的hNIS基因具有摄碘功能；hTERT启动子在肿瘤细胞内能够有效地启动hNIS基因表达。

2.2 Western blot检测 使用 Western blot分析hNIS基因蛋白质表达水平。在U87细胞系中，hNIS蛋白在70 kDa有表达带，见图1。

3 讨论

报告基因显像是一种分子水平显像方法。随着研究的深入，人们逐渐发现了一些问题：如现有的报告显像基因进入人体需要合适的载体。目前常用的载体有脂质体和病毒，但可惜的是，脂质体载体不能进行基因活体转染；病毒载体中腺病毒等非逆转录病毒载体只能实现瞬时表达[8]；慢病毒载体等逆转录病毒载体，虽能实现稳定表达，但因其安全性问题和出毒量低等问题，也不十分理想。

PET和SPECT等核医学设备因具有高灵敏度更方便进行相关报告基因显像[9]。NIS基因已经被证明具有作为报告基因的潜力。NIS基因能表达一种膜蛋白并将细胞外碘转入细胞内，该蛋白能介导放射性核素进行显像，如适用于SPECT的131I和123I，适用于PET的124I等。虽然NIS最重要的生理作用是转运碘，但也能转运其他结构类似的阴离子，如不仅与碘具有类似的理化性质，而且在放射性核素显像中具有相似的生物分布，所以同样可用于显像[10]。NIS基因作为一种报告基因具有非免疫原性、生理性表达只限于特定组织器官的优点[11]。

hTERT启动子等肿瘤特异性启动子，用来在胶质瘤中诱导特定基因表达的基因治疗已得到了证实[12]。如Takeuchi等[13]已证实使用hTERT启动子系统诱导半胱天冬酶 (caspase)治疗胶质瘤获得成功等。hTERT启动子在肿瘤目标性治疗中是一个很有希望的肿瘤选择性启动子[14-15]。

此次研究是利用重组腺病毒在端粒酶阳性的胶质瘤U87荷瘤裸鼠进行体内转染及核素显像的可能性进行的。在前期研究中已发现使用hTERT启动子限制hNIS基因表达的腺病毒Ad-hTERT-hNIS，可以实现在端粒酶阳性的胶质瘤细胞中引导hNIS基因的表达，而在端粒酶阴性的MRC-5细胞中则不能达到表达hNIS基因的目的。通过进行体内显像实验，发现Ad-hTERT-hNIS转染荷瘤裸鼠24 h后可以实现荷瘤裸鼠体内转染和显像，但因为载体本身的限制，显像时间很有限，超过一定时间后就不再能进行显像。因为正常甲状腺组织具有选择性摄取和浓聚99Tcm的能力，虽然事先对裸鼠的甲状腺进行了左甲状腺素屏蔽，但是屏蔽效果不理想，在裸鼠显像中仍可看见裸鼠甲状腺显影。这都是在今后需要研究的问题。

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