双酶传感器对大鼠血清与腹腔巨噬细胞内葡萄糖和胆固醇的同时检测

2012-10-19黄齐林安雅睿江小丽毕文姬金利通

化学传感器 2012年1期

黄齐林，安雅睿，江小丽，陈华，毕文姬，张文*,金利通

（1.华东师范大学化学系，上海200062）

（2.玉溪师范学院化学系，云南玉溪653100）

动脉粥样硬化是一种慢性炎症病变，病理学研究发现巨噬细胞内胆固醇沉积形成粥样斑块可引发血管管腔变细[1～2]。数据表明，动脉粥样硬化是糖尿病患者发病和死亡的主要原因，超过65%的糖尿病患者死于动脉粥样硬化及其并发症[3]。研究发现，大鼠巨噬细胞内胆固醇含量随着葡萄糖含量的增加而升高，且巨噬细胞内胆固醇的大量沉积是动脉粥样硬化的主要病因[4～5]。为了探究高血糖和胆固醇在糖尿病引发动脉粥样硬化过程中的作用，有必要建立同时检测大鼠血清和腹腔巨噬细胞内葡萄糖和胆固醇含量的有效实验方法。

该文研制了一种新型双酶生物传感器，用于大鼠血清与腹腔巨噬细胞（PMs）内葡萄糖和胆固醇的同时检测。首先在双电极表面电聚合硫堇；然后将金纳米粒子固定在聚硫堇（PTH）表面，吸附金纳米粒子的聚硫堇不仅能够保持酶的催化活性，而且可作为介电中心提高电子转移速率；最后用壳聚糖做交联剂将葡萄糖氧化酶(GOD)、胆固醇酯酶(ChE)和胆固醇氧化酶(ChOx)分别共价键合在双电极的聚硫堇层上。通过检测双电极上的氧化电流大小即可间接检测到葡萄糖和胆固醇的浓度。葡萄糖传感器的线性范围为8.0×10-6～6.0×10-3mol/L，检测限为 2.0×10-6mol/L；胆固醇传感器的线性范围为2.0×10-6～1.0×10-3mol/L，检测限为 0.6×10-6mol/L。结果显示该双酶传感器灵敏度高，选择性好。该传感器成功用于同时检测糖尿病大鼠血清及腹腔巨噬细胞内的葡萄糖和胆固醇的含量，取得令人满意的结果。

1 结果与讨论

1.1 双酶传感器的作用机理

同时检测葡萄糖和胆固醇的电化学实验原理是将酶催化反应和在酶活性中心和电极表面的电子媒介体（ETM）相结合。具体机理如图1所示。GOD和ChOx均含有一种氧化还原活性中心，核黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），该活性中心能够分别将葡萄糖和胆固醇催化水解为葡萄糖酸内酯和4-胆甾烯-3-酮。同时，FAD被还原为FADH2。该催化过程中失去的2个电子将在PTH的两电子/两质子的可逆传递过程中被传递至电极表面，两电极上生成的电流与葡萄糖或胆固醇的浓度相关。

图1 双酶传感器的作用机理

1.2 线性范围与检测限

图2为葡萄糖传感器和胆固醇传感器的标准曲线图。葡萄糖传感器在8×10-6～6×10-3mol/L范围内呈线性，线性相关系数为0.998 7，检测下限为 2.0×10-6mol/L（3 倍信噪比）；胆固醇传感器的线性范围为2×10-6～1×10-3mol/L，线性相关系数为 0.998 3，检测下限为 0.6×10-6mol/L（3 倍信噪比）。

图2 （A）葡萄糖传感器的标准曲线，（B）胆固醇传感器的标准曲线，内插图均为在0～1.0×10-3mol/L浓度范围内，相应传感器的标准曲线

1.3 双酶传感器的选择性

尿酸（UA）和抗坏血酸（AA）是血清和腹腔巨噬细胞中的主要电活性小分子，可能会干扰传感器对被分析物的测定，该文对此进行了讨论，如图3所示。从图中可以看出，连续交替加入20 μmol/L UA和20 μmol/L AA对葡萄糖传感器和胆固醇传感器都无明显影响。该文还讨论了双电极之间的交叉干扰。在60 μmol/L UA和60 μmol/L AA的存在下，向溶液中先后连续加入0.5 mmol/L的胆固醇和葡萄糖，从图3可以看出，胆固醇传感器对胆固醇具有良好的电流响应，对葡萄糖的加入无明显响应；同样，葡萄糖传感器对葡萄糖也有很好的响应，对胆固醇无响应。

1.4 实际样品分析

该文利用建立的传感器对大鼠血清及腹腔巨噬细胞内的葡萄糖和胆固醇进行了同时检测。实验结果如表1所示，与对照组相比，糖尿病大鼠血糖增加了229%，血胆固醇仅增加16%。而巨噬细胞内，胆固醇和葡萄糖的含量均有明显增加，其中葡萄糖含量增加了258%,胆固醇含量增加了113%。实验结果表明糖尿病体内高的葡萄糖含量会通过增加巨噬细胞内胆固醇的含量，有可能进而引发动脉粥样硬化。

图3 双酶传感器对 UA(20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L)、AA(20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L)、葡萄糖(0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L,0.5 mmol/L)和胆固醇(0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L,0.5 mmol/L)的电流-时间响应