基于CIEF的全柱成像检测在生命分析中的应用

于建钊

(南京大学化学化工学院，南京210093)

毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing，CIEF)是指在毛细管中进行的等电聚焦[1].CIEF是根据物质的等电点(pI)不同而进行分离的.采用两性电解质混合物作为载体电解质，当在用溶质和两性电解质混合溶液充满的毛细管两端加电场时，带电的两性离子和蛋白质以不同的速度迁移通过介质，带正电的向负极迁移，带负电的向正极迁移，当它们迁移至pH=p I的区带时，静电荷为零，不再迁移，这个过程称为等电聚焦.CIEF是分析两性生物分子的强有力工具，具有分离时间短、分辨率高、进样量少等优点.但传统的CIEF使用单点检测器，即使所有样品在到达检测器前已经完成分离，也要等到所有聚焦区带都通过检测器后才能结束分离检测.从形成pH梯度到样品聚焦完成通常只需要5 min，而聚焦区带依次通过检测器却需要10～40 min，不仅增加了额外的分析时间，并且移动过程会导致分离谱带展宽而影响分离度和分辨率，还可能导致蛋白质沉淀.

全柱成像检测(whole column imaging detection，WCID)是Pawliszyn等自1992年发展起来的一项检测技术[2－7].信号可以是折射率变化、紫外吸收、激光诱导荧光.折射率变化检测器是通用检测器，但灵敏度较低，在最佳条件下对蛋白质的检测限仅为10－6M.激光诱导荧光检测器具有非常高的灵敏度，检测限可达10－12M，但荧光标记可能会使蛋白质或肽的等电点改变.紫外吸收检测器灵敏度介于前两者之间，不需要对待测物进行荧光标记，适用于大部分蛋白质.目前，基于紫外吸收全柱成像检测的商品化毛细管等电聚焦仪(iCE280 Analyzer)已被推出.该仪器广泛用于蛋白质、多肽等生物分子的微观不均一性表征和质量控制.

WCID克服了传统CIEF的不足，采用一个动态检测器如电荷耦合装置(CCD)照相机或光二极管阵列(PDA)对整个分离毛细管柱(5 cm或更短)进行实时检测.整个毛细管内不同时间与不同位置上发生的任何事件均能得到检测.WCID不仅能对样品进行常规的分离分析，还能在分离的同时提取出有关动态过程的动力学参数，从而获取多重信息.因此，CIEF－WCID技术在生物样品的分离分析、蛋白质组学的研究中有着广泛的应用前景.

1 生物样品的分离分析

1.1 等电点的测定

CIEF－WCID技术可以应用于蛋白质或其他他两性物质等电点的测定.向待测样品中加入等电点标记物(p Imarkers)作为内标，通过比较谱图中待测物质峰与等电点标记物峰的相对位置，即可得到待测物质的等电点信息.本法测得的等电点，其标准偏差小于0.01个pH单位[8].

应用本方法，Wu等[9]实现了人体血红蛋白变异体、细胞色素C、肌红蛋白和转铁蛋白4种蛋白质样品的分离与等电点测定的同时进行.Wu等[10]使花生过敏源及其抗体的等电点得到验证，整个过程仅仅用时320 s，和凝胶等电聚焦相比大大缩短了分析时间.本方法不仅适用于蛋白质或肽，还被用来测定病毒这种由蛋白质包裹遗传物质而形成的复合体的等电点.Goodridge等[11]测定了诺罗病毒(norovirus)的病毒样颗粒的等电点，所得数据具有良好的重现性，且与理论计算的数值相符.

1.2 糖型的分离

应用CIEF－WCID，Dou[12]等建立了分离促红细胞生成素(EPO)糖型的快速高分辨分析方法(图1).该方法不仅可以直接应用于重组EPO的质量控制分析，而且对体育运动中EPO作为兴奋剂的检测具有重要意义.

1.3 蛋白质的快速二维表征

最近，CIEF－WCID还被用于蛋白质的快速二维表征:首先利用毛细管等电聚焦测定蛋白质的等电点，然后取消聚焦电压，利用全柱成像检测测定蛋白质的扩散系数，进而估算蛋白质的分子质量.Liu[13]等选取了16种不同的氨基酸和蛋白质(分子质量从295～272 000)进行测试.同经典的二维凝胶电泳相比，本方法具有快速，易于操作，结果更准确等优势.本方法可以实现低到中等复杂程度的蛋白质样品的快速二维表征.

图1 EPO的等电聚焦图

2 研究蛋白质与其配体的相互作用

2.1 蛋白质之间的相互作用

蛋白质之间存在很强的相互作用时，蛋白质的等电点会发生改变，当相互作用足够强时就会形成蛋白质的络合物或者结合物.应用全柱成像技术我们能监测到整个过程，进而研究蛋白质的相关性质.Wu[14]等把牛血清白蛋白(BSA)、链霉亲和素(streptavidin)和生物素标记的牛血清白蛋白(biotin－labeled－BSA)作为模型蛋白，成功展示了该方法的可行性.将BSA与streptavidin混合后进行等电聚焦，经全柱成像检测发现:与分别进样相比，既没有新峰出现，原来两种蛋白质峰的位置也没有任何改变.这表明两种蛋白质等电聚焦过程是相互独立的，它们之间没有强的相互作用.然而将biotin－labeled－BSA和streptavidin混合进样时，聚焦谱图显示有一新峰出现，这个新峰属于二者的络合物，由此说明二者之间有极强的亲和力.此方法进一步应用于免疫反应的研究.例如，花生过敏原Ara hⅠ、Ara hⅡ与兔 γ－球蛋白的反应[10].固定过敏原溶液(Ag)含量，改变γ－球蛋白(rabbit IgG antibody，Ab)的含量，分别进行等电聚焦，比较全柱成像谱图可知:随着Ab含量的增加，Ara hⅡ的聚焦区带比Ara hⅠ的聚焦区带先消失(图2)，这表明在免疫反应中Ara hⅡ与抗体的亲和力更强.此外，Liu和Pawliszyn[15]利用非共价的荧光染料(NanoOrange)标记MS2病毒、抗体和二者形成的免疫复合体，并通过激光诱导荧光全柱成像观察了它们在免疫反应中的改变，进而发现病毒与抗体的相对浓度对形成的免疫复合体的微观不均一性有很大的影响.

图2 花生过敏源(Ag)与兔γ－球蛋白(Ab)混合物的等电聚焦图

2.2 蛋白质与DNA的相互作用

近来，利用全柱成像技术建立了一种研究蛋白质与DNA相互作用的新方法——动态动力学毛细管等电聚焦法(dynamic kinetic capillary isoelectric focusing).该方法将相互作用的蛋白质与DNA混合，将混合物等电聚焦，通过全柱成像观察，蛋白质和蛋白质－DNA复合物将会聚焦成区带，而非结合DNA(包含未结合部分和由于离解而释放的部分)在电场的作用下将迁移出分离柱.随着复合物的离解，其峰面积将逐渐减小(图3).利用峰面积的自然对数对离解时间作图，即可得到相关的离解速率常数.该方法成功测定了单链DNA结合蛋白(single－stranded DNA binding protein)和寡核苷酸(oligonucleotide，fDNA)的离解速率常数并表征了蛋白质和DNA间的特异和非特异相互作用[16].利用该方法，核酸酶P1不能完全酶解某些DNA样品的原因得到确认，即:DNA与蛋白质非特异性结合形成复合物，因而降低了酶解效率[17].

图3 不同离解时间条件下SSB－fDNA复合物CIEF谱图

2.3 蛋白质与磷脂的相互作用

蛋白质与磷脂之间的相互作用在蛋白质同磷脂膜的结合过程中起着重要作用.当磷脂与蛋白质存在相互作用时，会改变蛋白质的结构进而改变其等电点.应用CIEF－WCID技术，Bo等对磷脂与蛋白质之间的相互作用做了一系列研究[18－20].此项研究首先考察了7种不同等电点的蛋白质与两性卵磷脂之间的相互作用.7种蛋白质的化学、物理性质不同，与卵磷脂的相互作用也不同，这点在聚焦谱图中得到了充分的展示.其次，钙离子的存在会对磷脂与蛋白质相互作用产生影响.一方面，钙离子能够嵌入磷脂膜中，改变膜的性质.另一方面，钙离子与不同蛋白质的结合作用，改变蛋白质的构象.二者共同影响磷脂与蛋白质之间的相互作用.之后，磷脂与蛋白质之间相互作用的动态过程得到监测，其结果表明疏水作用、静电作用和氢键作用是影响蛋白质与磷脂膜相互作用的主要因素，而蛋白质在与磷脂膜相互作用时有多个结合位点，不同结合位点的结合机理不同.

2.4 蛋白质与药物的相互作用

CIEF－WCID还是一种简单、方便的研究蛋白质与药物相互作用的方法.其研究结果为进一步了解药物的活性和毒性提供有用的信息进而改善它们的临床效果.

将药物与靶蛋白以不同物质的量比混合(1∶1、1∶10、1∶50、1∶100)，在37℃下反应.分别取不同反应时间(0、0.5、1、4、6、8、12、24、48 h)的混合物进行等电聚焦，与靶蛋白作对照.通过全柱成像观察(图4)，发现药物的加入会使蛋白质的等电点有所改变，并且随着作用时间的增加，这种改变越来越明显，蛋白质的峰会逐渐展宽、减小直到消失.等电点的改变和药物引起的蛋白质峰的消失表明了蛋白质与药物之间存在很强的相互作用.而峰的展宽可能是由于靶蛋白与药物有多个结合位点，因而生成了多种复合物.这些现象对研究多大药物剂量才会影响蛋白质结构有着重要意义.此方法已应用在含铂抗癌药物与人血红蛋白(human hemoglobin)、人血清白蛋白(human serum albumin)的相互作用的研究中[21－22].

图4 人血红蛋白与含铂抗癌药物(物质的量比1∶10)作用不同时间的谱图

3 蛋白反应机理的研究

蛋白反应在生物学，生物化学和生物技术中有着重要作用.通常，蛋白质的变性，还原，酰基化等反应会改变蛋白质的结构、构象或带电基团，从而引起蛋白质等电点的变化.因此，等电聚焦能够很好的监测这些反应，提供反应的动力学或是中间产物的寿命等信息.

Liu等[23]应用CIEF－WCID技术监测了蛋白质变性、还原和氨基甲酰化的动力学过程.聚焦区带清楚地显示出反应不同时间生成的物质不同并且蛋白质不完全变性的中间产物与完全变性产物相比有着更高的等电点.当蛋白质同尿素溶液相互作用时，其氨基甲酰化产物得到检出，同原蛋白质相比其等电点有显著降低(图5).通过此种方法，这些反应的机理得到了合理的解释.并得出结论:在高浓度的尿素条件下，蛋白质的变性过程可能是变性反应和还原反应共同作用的结果.采用CIEF－WCID对蛋白质的反应机理进行研究有着显著优点:首先，毛细管等电聚焦只对两性物质有作用，这样就避免了非两性物质的干扰.其次，使用激光诱导荧光检测器可以获得高的灵敏度.最后，分析时间短.每次分析只需要10 min，而常规的光谱分析法却需要几个小时.

图5 不同反应时间6M尿素溶液中绿色荧光蛋白的等电聚焦图

4 结语

毛细管等电聚焦－全柱成像检测是20世纪90年代初发展起来的一项检测技术.该技术创新性的将常规分离方法中单点检测方式改为多点检测方式，由于样品区带不需要转移，因此缩短了分析时间，提高了分辨率.同时由于对分离毛细管内的情况进行实时监测，可以得到更多信息，如样品的相互作用过程，扩散系数等.因而该技术在生物分子的分离分析、蛋白质与配体的相互作用及其机理的研究中有着越来越广泛的应用.而随着更灵敏CCD的出现，荧光标记和检测技术的发展，以及在线富集技术的联用和多功能集成化的微流控芯片的采用，毛细管等电聚焦－全柱成像检测技术必将有着更进一步的发展.

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