非小细胞肺癌中RECK和MMP-9的表达及其临床意义

罗湘玉 郑雪松 罗卫民

湖北医药学院附属太和医院胸心外科，湖北十堰 442000

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一，占所有新发恶性肿瘤的12.4%，其死亡率位居恶性肿瘤的首位。其中以非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）最常见（占所有肺癌的80%以上）[1]。肿瘤的侵袭性转移是导致患者死亡的首要原因[2]。基序逆向诱导半胱氨酸丰富蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs，RECK）是Takahashi于1998年发现的一种抑癌基因，它能抑制基质金属蛋白酶（matrix metalproteinase，MMP）的活性，从而抑制肿瘤细胞的浸润性生长以及血管生成。研究表明，多种恶性肿瘤组织RECK基因表达缺失，且其表达含量与肿瘤的侵袭转移呈负相关[3]。本研究通过免疫组化等方法检测NSCLC中RECK以及MMP-9的表达情况与临床病理资料的关系，以进一步明确其在肺癌侵袭转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究组标本来自2008年2月～2011年10月我院心胸外科住院患者手术切除NSCLC组织66例，所有患者拥有完整的随访资料，在手术前均为接受放疗、化疗等抗肿瘤治疗。其中男42例，女24例，年龄37～71岁，中位年龄62岁。所有标本均经病理学证实：鳞癌36例，腺鳞癌30例。中分化以上40例，低分化26例。根据UICC分期标准，Ⅰ期21例，Ⅱ期18例，Ⅲ期19例，Ⅳ期8例。其中淋巴结转移39例，无转移者27例。对照组标本为同期我院30例炎性假瘤患者。男17例，女13例，年龄34～69岁，中位年龄55岁。

1.2 主要试剂

兔抗人RECK以及MMP-9兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruze（北京中山金桥）。DAB显色试剂盒购自福建迈新公司。其余试剂均为分析纯产品，主要购自上海生工和索莱宝公司。

1.3 免疫组化方法

所有石蜡标本切成4 μm厚度后放入70℃烤箱中烘烤3 h，经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，将切片置于柠檬酸液中也中进行抗原修复，并于室温自然条件下冷却，PBS洗涤3次后，用3%H2O2溶液室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶活性。PBS洗涤后加入相应抗体孵育过夜，随后加入通用型聚合物辅助剂室温孵育30 min，洗涤后，加入HRP标记IgG二抗孵育30 min，PBS洗涤后DAB显色，苏木素复染，梯度脱水干燥，中性树胶封固后显微镜下观察。

1.4 结果判断

高倍镜下选取5个视野，根据阳性细胞的比例及颜色深浅进行判定：①阳性细胞数目：无阳性细胞计0分；0＜阳性细胞数≤25%计1分；50%≥阳性细胞数＞25%计2分。②表达强弱度：阳性信号强烈，细胞呈棕褐色计3分；阳性信号中等，棕色，细胞呈颗粒状计2分；信号较弱，细胞呈淡棕色或细颗粒状，计1分；无阳性信号计0分。以对应上两项计分相加，0 分：（-），1～3 分：（+），4～5 分：（++），6～7 分：（+++）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。MMP-9、RECK阳性表达率和临床病理特征之间的关系采用χ2检验或Fisher确切概率法。RECK与MMP-9的相关性采用Spearman等级相关检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-9和RECK在NSCLC中的表达

RECK和MMP-9主要表达与细胞浆中，为不同程度的淡黄色或棕褐色颗粒，散在或片状分布。在NSCLC中，MMP-9和RECK的阳性表达率分别为75.6%（50/66）和40.9%（27/66）。而在正常肺炎性假瘤组织中，两者表达率分别为33.3%（10/30）和 93.3%（28/30）。 经统计学分析，MMP-9 在 NSCLC中的表达水平明显高于肺炎性假瘤患者，而RECK的表达水平较低（P＜0.05）。 见表1。

表1 NSCLC中RECK及MMP-9表达情况（例）

2.2 RECK与NSCLC临床病理特征之间的关系

RECK与患者原发肿瘤的大小、病理学类型以及分化程度之间差异无统计学意义（P＞0.05），但与淋巴结转移及TNM分期相关（P＜0.05）。在无淋巴结转移的患者当中，RECK的表达显著高于淋巴结转移患者，Ⅰ～Ⅱ期患者RECK表达高于Ⅲ～Ⅳ期患者（P＜0.05）。见表2。

2.3 MMP-9与NSCLC临床病理特征之间的关系

MMP-9的表达与原发肿瘤大小、病理学类型以及分化程度之间差异无统计学意义（P＞0.05）。在有淋巴结转移的患者当中，MMP-9表达显著高于无淋巴结转移患者，Ⅰ～Ⅱ期患者MMP-9表达低于Ⅲ～Ⅳ期患者（P＜0.05）。见表3。

表2 NSCLC患者中RECK的表达与临床病理特征的关系

表3 NSCLC患者中MMP-9的表达与临床病理特征的关系

2.4 RECK与MMP-9表达的相关性

经 Spearman相关性分析，r=-0.517，P＜0.01。 表明RECK与MMP-9的表达呈明显的负相关。见表4。

表4 RECK与MMP-9的相关性分析

3 讨论

肺癌细胞浸润性生长和转移，首先必须具备分解基底膜以及细胞外基质（ECM）的能力。在众多的MMP当中，以MMP-9最重要。它不仅可降解ECM，而且能促进血管的发生。生理条件下，组织中MMP-9表达量极低，而在多种肿瘤细胞中，其表达量显著增高，且与侵袭力呈正相关。Zhang等对不同分期的NSCLC患者体内MMP-9 mRNA表达水平进行了研究，结果显示，Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-9 mRNA水平显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者，MMP-9阳性者其5年生存率明显低于MMP-9低表达者[4]。Stenvold等采用免疫组化等方法检测了325例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者MMP-9的表达情况，结果显示NSCLC患者中MMP-9表达显著增高，并且MMP-9的高表达可能与预后不良密切相关[5]。因此，Sienel等认为MMP-9的表达水平可作为预测NSCLC术后预后的重要指标[6]。本实验研究结果表明，MMP-9在正常肺炎性假瘤中的表达较低，而在非小细胞腺癌中表达较高，其表达水平与肿瘤大小以及分化程度无关。提示MMP-9的表达可能与肺癌的侵袭过程有关。MMP-9的异常增高有利于肿瘤细胞从原发部位脱落并随血液和（或）淋巴循环形成新成新的转移灶。MMP-9对ECM的反复降解，又有利于新发肿瘤病灶中淋巴管的产生，从而形成恶性循环[7-8]。

RECK作为新发现的MMP-9的抑制物，可有效抑制肿瘤细胞的侵袭与转移。在本实验中，笔者首次揭示了RECK基因的表达与非小细胞癌以及淋巴结转移之间的关系。其中在肺癌组织中，RECK的阳性率仅40.9%，明显低于肺炎性假瘤，与国外研究结果一致[9]。但不同分化的肺癌组织中RECK阳性率差异无统计学意义，表明其与细胞分化无关。此外，RECK的阳性表达率随临床分期的增加而降低，提示RECK的正常表达对肺癌的发生发展起一定程度的抑制作用。因此检测NSCLC患者体内RECK的表达水平可能对其预后的评估具有一定的临床意义。本研究还证实，RECK的阳性率还与淋巴结转移有关，其机制可能与Kras的突变有关。Pesta等[10]发现，RECK的低表达可能与其启动子区域的甲基化有关。本研究还对RECK与MMP-9的表达情况作了Spearman分析，结果证实RECK与MMP-9的表达呈负相关。这再次说明RECK基因通过抑制MMP-9而发挥抑制肿瘤转移到作用[11]，因此，RECK、MMP-9的检测能反映肺癌发生淋巴结转移，并有望成为肺癌预后评估的有效指标及新的治疗靶点。

[1]Cagle PT，Allen TC，Dacic S，et al.Revolution in lung cancer： new challenges for the surgical pathologist[J].Arch Pathol Lab Med，2011，135（1）：110-116.

[2]Blanco M，Garcia-Fontan E，Rios J，et al.Pulmonar collision tumor：metastatic adenoid cystic carcinoma and lungadenocarcinoma [J].Rev Port Pneumol，2012，18（1）：42-45.

[3]Noda M，Takahashi C，Matsuzaki T，et al.What we learn from transformation suppressor genes：lessons from RECK [J].Future Oncol，2010，6（7）：1105-1116.

[4]Zheng S，Chang Y，Hodges KB，et al.Expression of KISS1 and MMP-9 in non-small cell lung cancer and their relations to metastasis and survival[J].Anticancer Res，2010，30（3）：713-718.

[5]Stenvold H，Donnem T，Andersen S，et al.Overexpression of matrix metalloproteinase-7 and-9 in NSCLC tumor and stromalcells：correlation with a favorable clinical outcome [J].Lung Cancer，2012，75（2）：235-241.

[6]Sienel W，Hellers J，Morresi-Hauf A，et al.Prognostic impact of matrix metalloproteinase-9 in operable non-small cell lung cancer [J].Int J Cancer，2003，103（5）：647-651.

[7]Zheng S，Chang Y，Hodges KB，et al.Expression of KISS1 and MMP-9 in non-small cell lung cancer and their relationsto metastasis and survival[J].Anticancer Res，2010，30（3）：713-718.

[8]Shao W，Wang W，Xiong XG，et al.Prognostic impact of MMP-2 and MMP-9 expression in pathologic stage IA non-small cell lung cancer[J].J Surg Oncol，2011，104（7）：841-846.

[9]Chang HC，Cho CY，Hung WC.Downregulation of RECK by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in non-small cell lung cancer[J].Cancer Sci，2007，98（2）：169-173.

[10]Pesta M，Kulda V，Topolcan O，et al.Significance of methylation status and the expression of RECK mRNA in lung tissue of patients with NSCLC[J].Anticancer Res，2009，29（11）：4535-4539.

[11]Golan K，Vagima Y，Goichberg P，et al.MT1-MMP and RECK：opposite and essential roles in hematopoietic stem andprogenitor cell retention and migration[J].J Mol Med（Berl），2011，89（12）：1167-1174.