高山杜鹃花苞组织培养和优化体系的建立

王蔚琼，肖建忠* ，李志斌，胡建敏，白霄霞

(1河北农业大学园林与旅游学院，河北保定，071001;2石家庄市农林科学研究院)

高山杜鹃(Rhododendron lapponicum)为杜鹃花科杜鹃属，属于常绿灌木，原产我国中西部地区的高山密林中，后由德国、比利时等国引种栽培驯化，并改良选育出许多优良品种;一个花苞中有十几朵小花，呈球形开放，艳丽华贵，深受人们喜爱［1～3］。高山杜鹃枝粗叶少，无种子，通常靠扦插繁殖［4］，但生长周期长，繁殖系数低，扦插成活率低，同时受母株材料和繁殖季节影响，常规的繁殖方法无法满足高山杜鹃目前的需求［5］。而通过组织培养，则繁殖速度快，繁殖系数高［6］，不受季节影响，对优良品种的引进和推广有重大意义。我国从20世纪80年代开始杜鹃组织培养的研究，目前有秦静远等［7］以叶片为外植体，通过脱分化、再分化途径获得了完整植株，而 Lapichino，John E．Preece 和 Miles R．lmel等［8～11］直接从叶片上得到丛生芽;杨乃博［12，13］、阙国宁［14］、董春枝等［15］、陈振光等［16］对春夏鹃、锦绣杜鹃和西洋杜鹃的少数品种进行过组织培养研究;汤桂钧等［17，18］曾用茎尖和茎段作为外植体，对部分品种进行快繁，掌握高山杜鹃组织培养快速繁殖技术体系;但有关高山杜鹃用花苞作为外植体进行组织培养的还未见报道。笔者拟利用花苞为外植体，对高山杜鹃“粉冠博士”进行快速繁殖，为工厂化育苗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 供试材料

试验材料由河北省石家庄市农林科学研究院提供，为高山杜鹃“粉冠博士”品种。

1．2 外植体准备

高山杜鹃花苞一般在9月份发育成熟，之后处于休眠状态，一般到次年的2月份开始萌动。因此，选取12月份长势旺盛的花苞作为外植体，然后在无菌室超净工作台上取出花苞中单个小花苞，用体积分数为0．75的酒精浸泡30 s，用无菌水冲洗3遍;再用质量浓度为1．0 g/L的升汞浸泡30 s，最后用无菌水冲洗5遍，放于无菌棉纱布凉干以备接种用。

1．3 无菌培养系的建立

外植体诱导初始无菌芽的培养基为:

(A)MS+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L

(B)WPM+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L

(C)Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L

3种培养基中蔗糖的质量浓度为30 g/L，倍立凝的质量浓度为10 g/L，pH值为6．0～6．3，培养室温度为(23±1)℃，光照度为2 000－3 000 lx，每天光照时间为12 h。每个处理15瓶，每瓶2个小花苞，重复3次。45，60 d后统计芽的诱导率。

1．4 继代增殖培养

将诱导出的长度大于0．8 cm的不定芽进行继代培养。增殖培养基为:以Anderson为基本培养基，添加的生长调节剂为IAA和KT，具体处理见表1。

培养期间光温条件与“1．3无菌培养系的建立”中的初代培养阶段相同。每个处理10瓶，每瓶1个不定芽，3次重复。统计分化率、增殖系数、玻璃化程度。

分化率=(分化外植体数/外植体总数)×100%

增殖系数=芽总数/产生芽外植体数

玻璃化程度:1，＜5%;2，5% ～15%;3，＞15%。

1．5 生根培养

1．5．1 不同生长素对高山杜鹃生根的影响 将在Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 3．0 mg/L培养基上长度达到3 cm，叶片4叶以上、叶色深绿、健壮的芽进行生根培养。

生根培养基为:以1/2 Anderson为基本培养基，添加的生长调节剂为NAA和IAA，具体处理见表2。

培养期间光温条件与“1．3无菌培养系的建立”中的初代培养阶段相同。每个处理10瓶，每瓶2株，3次重复。40 d统计生根率。

表1 高山杜鹃继代增殖培养的不同生长调节剂处理

表2 高山杜鹃生根培养的不同生长调节剂处理

1．5．2 活性炭(AC)对高山杜鹃组培苗生根的影响 切取生长旺盛，长势大体一致的芽(长度2～3 cm)，分别接种于Anderson(大量减半)+IAA 4．0 mg/L和Anderson(大量减半)+IAA 4．0 mg/L+AC 3．0 mg/L的生根培养基上，每个处理10瓶，每瓶2株，3次重复。1个月后观察根长势情况，统计生根率。

1．6 组培苗的炼苗移栽

将生根的组培苗的瓶口打开，在培养室散射光下进行开口炼苗，使嫩苗逐渐和外界接触，提高适应能力，一周后取出单苗，洗净根上带的培养基，把根在质量浓度为2．0 g/L的多菌灵溶液中浸泡3 min，栽入以下不同基质中，观察组培苗的生长情况。

移栽基质为:1，国产草炭;2，进口草炭;3，v国产草炭∶v进口草炭=1∶1;4，v进口草炭∶v珍珠岩=3∶1。

移栽前将基质浇透水，移栽后叶面喷水，用塑料薄膜覆盖，相对空气湿度在70% ～90%之间，20 d后观察记录其生长状况并统计成活率。

2 结果与分析

2．1 初始无菌培养系的建立

从芽诱导率来看，C培养基中芽诱导率显著高于其它两种培养基，45 d时芽诱导率达到57．8%，60 d时芽诱导率达到74．5%(表3)。且C培养基中芽生长状况相对优于A，B培养基中芽生长状况。因此，C培养基最适宜于花苞的启动培养，即Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 12 mg/L。

表3 不同培养基对花苞启动培养的影响

2．2 继代增殖培养

当KT的质量浓度为0．5 mg/L，IAA的质量浓度为0．1～1．0 mg/L时，芽的增殖系数低，长势一般;而当KT的质量浓度为3．0 mg/L，IAA的质量浓度为0．1～1．0 mg/L时，芽的增殖十分明显，增殖系数为5．50～6．96(表4)。尤其当KT的质量浓度为3．0 mg/L，IAA的质量浓度为1．0 mg/L时，增殖系数达6．96，且芽的长势粗壮;而当KT的质量浓度提高至5．0 mg/L时，增殖系数为7．15～8．19，但芽长势细弱、叶色黄绿、部分芽成一堆状，主茎不明显，并且玻璃化程度严重，不利于继代增殖。经方差分析，KT的质量浓度为0．5 mg/L时的增殖系数与KT的质量浓度为3．0，5．0 mg/L的增殖系数差异显著(P＜0．05)。而各亚处理间的分化率无显著差异。综合各因素，最适宜继代增殖的培养基为Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 3．0 mg/L。

表4 不同生长调节剂组合对组培苗增殖培养的影响

2．3 生根培养

2．3．1 不同生长素对高山杜鹃生根的影响 木本观赏植物里，一些种类，IBA不仅促进生根效果好，而且根的进一步生长较正常;另一些种类，IAA和NAA也被广泛应用［19］。以1/2 Anderson为基本培养基，培养基中分别添加不同质量浓度的NAA和IAA，经过40 d培养后统计生根率。结果表明，10个处理中10号处理的生根率最高，为96．7%(表5);5号处理的生根率最低，仅为10%。在这10个处理中可以发现，含有IAA的处理中，生根率普遍高于含有NAA的。含有NAA的5个处理中，生根率最高仅达到43．3%，且生根状况一般，根较细。而含IAA的5个处理中，生根率最高达96．7%，且根系发达，根苗壮。这说明在高山杜鹃的生根培养中，IAA比NAA能更好的促进植株生根。

对组培苗生根率的统计分析显示，1/2 Anderson+IAA 4．0 mg/L培养基与其他9种培养基相比，差异显著(P＜0．05)。综合各因素，最适宜高山杜鹃“粉冠博士”生根的培养基为1/2 Anderson+IAA 4．0 mg/L。

表5 不同生长素对高山杜鹃组培苗生根培养的影响

2．3．2 活性炭(AC)对高山杜鹃组培苗生根的影响 AC能吸附培养基中的有害物质，因此对组培材料的生根有利，但其又能吸附培养基中的生长调节物质和其它成分，不利于生根［20］。在本次试验中活性炭对高山杜鹃的生根率基本上没影响(表6)，可能是由于活性炭对植物生根正负两方面的作用相互抵消的结果。但是它对于根的形态、生长状况有影响。有活性炭的培养基上的幼苗的根生长整齐，形态正常;无活性炭的培养基上的幼苗的根则不如有活性炭的培养基上的根整齐，这可能是因为培养基中生长素未被吸附，浓度较高的缘故。

表6 活性炭(AC)对高山杜鹃组培苗生根的影响

表7 基质对移栽苗成活率的影响

2．4 组培苗的炼苗移栽

不同基质对移栽成活有一定的影响(表7)。最有利于高山杜鹃“粉冠博士”组培苗移栽存活的基质类型为进口草炭和珍珠岩按体积比为3∶1的混合物，其次是进口草炭，再次是国产草炭和进口草炭按体积比为1∶1的混合物，最后是国产草炭。

3 讨 论

个别高山杜鹃品种的组织培养研究有过报道［5，17，18］，由于品种很多，所以用于组织培养的培养基、激素和添加物也比较多，本次试验仅研究了一个品种的培养基配比，所选出的最适培养基配方是否适用于其它品种有待进一步研究。

本次试验中确定了高山杜鹃“粉冠博士”组培繁殖的最适培养基，但无菌苗在继代过程中，随着继代次数的增加，植物激素在无菌苗体有量的积累过程，细胞分裂素的量过大，虽然也分化许多丛生芽，但芽的质量发生了变化，可能出现徒长现象，茎细嫩、颜色淡绿，所以继代次数多的情况下可以考虑适量减少激素的用量。本次试验还发现，虽然在高山杜鹃诱导过程中有玻璃化苗出现，但随着时间的推移，增加转接次数，玻璃化苗逐渐变为正常苗，只是苗质量欠佳。所以，减少玻璃化现象是高山杜鹃组培中一项需要解决的问题。

在应用组织培养技术进行观赏植物的快速繁殖中，繁殖系数是决定组培苗生产效益和成本的一个重要因素［17］。本次试验中发现，繁殖系数的高低主要取决于培养基中KT的用量，培养室温度的高低也有一定的调节作用。繁殖系数随KT浓度的提高而提高，但KT浓度过高，培养的组培苗细弱、主茎不明显、成一堆状、容易形成玻璃苗。本次研究中，为保证组培苗的质量，当培养获得丛生芽后，以Anderson+IAA 1．0 mg/L+KT 3．0 mg/L的培养基进行增殖培养效果较好。

试验中发现，将试管无根新梢置于Anderson即全量元素配方，不添加任何生长调节剂的培养基上壮苗培养1个月后再进行生根培养，对提高组培苗的质量及生根率具有促进作用，与汤桂钧等［17］对高山杜鹃“火箭”的研究中得出的结果一致。

组织培养技术的应用成败在很大程度上取决于组培苗移栽的成活率，移栽的基质是影响成活率的一个因素，基质透水性太好有利于移栽前期成活率的提高但不利于种苗的后期生长，对基质保肥不利，增加管理成本。试验表明，进口草炭、珍珠岩(体积比3∶1)比较适合，但移栽阶段的培养基质的设计不尽完善，目的性不强，至少应加国产草炭+珍珠岩)，这样比较用进口草炭与国产草炭及与其它基质不同比例混合后的效果，从而选择成活率高、成本较低的配比种类。所以，在以后的研究中有待进一步完善。

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图版说明:A，B为花苞外植体;C，D为花苞的启动培养;E，F为增殖培养;G为壮苗培养;H为生根培养;I，J为炼苗移栽。