HIV－1P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

汪龚泽，刘朝奇，杨建林，覃晓琳，吕佰瑞，姚佳红

（三峡大学分子生物学研究所，湖北宜昌443002）

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是艾滋病的病原体，主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来，HIV感染呈上升趋势。中国自1985年发现第一例艾滋病患者以来，截至2009年10月底，累计报告艾滋病病毒感染者和患者319 877例，2009年当年新发HIV感染者4.8万人，中国艾滋病疫情形势严峻［1］。而目前检测血清HIV抗体是诊断HIV感染的常规方法，但该检测具有较大的局限性，这是因为：超过70%的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体，在同性恋群体中，这个数字超过80%，检测抗体方法增加了HIV“窗口期”传播的危险［2］；另外，新生儿产生 HIV抗体一般在出生1年后，来自母体的HIV抗体造成新生儿假阳性；由于HIV抗体在疾病过程中持续存在，到艾滋病晚期才消失，它无法作为治疗监测的稳定指标［3］。

P24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白，是结构基因gag的产物，在病毒的包装和成熟过程中发挥重要作用［4］。P24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守，缺失P24的病毒无法正常组装。P24蛋白特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应。HIV感染人体后，感染者血液中首先出现的病毒标志物为病毒P24蛋白。由于从病毒感染到检出抗HIV抗体之间存在较长的窗口期，因此，HIV－1P24抗原检测在HIV感染的早期诊断、预后判断、抗HIV药物筛选及判断母婴传播等方面具有重要意义［5－6］。目前，人们在提高 HIV－1 P24抗原敏感性方面进行了不断的探索，dos Ramos Farías等［7］将婴儿的血清样本离心，可显著增加P24抗原检测的敏感性。瑞士逆转录病毒国家研究中心报道了一种缓冲液，在检测过程中使用该缓冲液可提高P24抗原的检测能力［8］。本课题组克隆表达P24蛋白，获得P24单克隆抗体细胞株，进行临床样本检测，为检测HIV感染提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 实验所需限制性内切酶、T4DNA连接酶及TaqDNA聚合酶均购自Fermentas公司。菌株E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、质粒pET28a（＋）和 HIV－1hbx2重组质粒由本研究所保存。鼠抗聚组氨酸（histidine，His）标签抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Balb／c小鼠购自湖北省实验动物中心。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（MW1500）购自Fluka公司。小鼠骨髓瘤SP2／0细胞为本研究所保存。

1.2 pET28a（＋）－p24基因重组质粒的构建 以 HIV－1hbx2基因为模板，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法扩增p24基因。设计引物为：5′－CAG GAT CCC TAT AGT GCA GAA CAT CCA GG－3′；5′－CGA CTC GAG CAA AAC TCT TGC CTT ATG G－3′，其引物中分别引入酶切位点BamHI／XhoI。原核表达载体pET28a（＋）用BamHI／XhoI双酶切将其线性化后，与p24目的基因的酶切产物于16℃连接过夜。5μL连接产物转入E.coli DH5α中，接种LB卡那霉素抗性固体培养基，37℃培养过夜，挑取单克隆至1.5mL卡那霉素LB培养基中，37℃培养过夜，次日提取质粒用于酶切和测序鉴定。

1.3 pET28a（＋）－p24基因原核表达与鉴定 将构建好的重组质粒pET28a（＋）－p24转化到宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基－D－硫 代 半 乳 糖 苷 （isopropyl－beta－D－thiogalactopyranoside，IPTG）（终浓度1.0mmol／L）诱导表达，收集的细菌加入等体积2×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝胶上样缓冲液，100℃煮沸3min，冰浴4min，室温下离心1min（离心半径8cm，12 000r／min），取20μL进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）［9］。考马斯亮蓝染色，通过凝胶成像系统检测表达产量。Western blot检测重组pET28a（＋）－P24蛋白，SDS－PAGE后转移硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭；加抗His标签单克隆抗体（1∶500）室温轻摇作用2h；TBST（Tris－buffered saline with Tween－20）洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000）室温反应2h，洗涤同上；增强化学发光法（enhanced chemiluminecence，ECL）显色。

1.4 pET28a（＋）－P24蛋白的纯化 质粒 pET28a（＋）－P24阳性菌BL21（DE3）经IPTG诱导表达，离心收集菌体，将细菌重悬 于 BufferA（0.5mol／L NaCl，20mmol／L Tris－HCl，pH 8.0）中，4℃超声波破碎细菌，离心洗涤包涵体，8mol／L尿素变性增溶，经Ni－NTA琼脂糖亲和柱分离纯化目的蛋白。纯化蛋白经透析法复性，尿素浓度梯度依次为6.00、4.00、2.00、1.00、0.25、0.10及0.00mol／L，每个浓度透析时间为12h。

1.5 制备P24单克隆抗体 以50μg P24蛋白抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内多点注射进行免疫。1个月后，用相同剂量的抗原加弗氏不完全佐剂经小鼠尾静脉进行加强免疫3次，每次间隔2周。经免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2／0细胞以50%PEG促融。培养至第10天，采用间接酶联免疫吸附测定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）法筛选阳性孔，有限稀释法克隆化3次至克隆生长孔100%阳性，克隆化后的细胞株经传代确定为稳定的细胞株后，液氮保存。每只Balb／c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL，10d后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1×106个，制备腹水模型。取腹水单克隆抗体经饱和硫酸铵分级沉淀，用双蒸水溶解，收集，加等量无菌丙三醇，于－20℃保存。

1.6 P24单克隆抗体的鉴定及抗体效价的检测 Western blot鉴定P24单克隆抗体：取P24蛋白及阴性和阳性对照蛋白进行SDS－PAGE，制备抗原条带。用5%脱脂奶粉封闭，分别以His标签抗体、P24单克隆抗体或正常小鼠血清作为第一抗体（1∶500）室温轻摇作用2h；TBST洗涤3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000）室温反应2h，洗涤同上；ECL显色。ELISA法检测抗体效价：用碳酸盐缓冲液包被P24抗原（浓度为1μg／mL、每孔100μL）4℃包被16h，使用PBST（phosphate buffered solution with Tween－20）洗 涤ELISA板3次，37℃封闭1h。每块ELISA板分别以稀释倍数为1∶100、1∶500、1∶2 500、1∶12 500、1∶62 500、1∶312 500、1∶1 562 500的抗体作为第一抗体加入ELISA板，其中以PBST代替P24单克隆抗体作为阴性对照。37℃孵育1h后，用PBST洗涤ELISA板3次，并在洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000）作为第二抗体，37℃孵育1 h后，洗涤同上，四甲基联苯胺显色，2mol／L H2SO4终止反应，在450nm波长处检测吸光度值。

1.7 血清P24含量的检测 采用竞争抑制ELISA方法，用碳酸盐缓冲液包被P24抗原（浓度为1μg／mL、每孔100μL），37℃封闭1h。每孔加入P24单克隆抗体（1∶200）和不同浓度的P24蛋白于37℃孵育1h，其中阴性对照不加P24单克隆抗体，阳性对照不加P24蛋白。洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶2000），37℃孵育1h，洗涤同上，四甲基联苯胺显色，检测吸光度值，绘制标准曲线。以P24蛋白为抗原包被，包被浓度同上，0.5%Triton X－100处理 HIV－1阳性的血清样本，1∶50稀释后，与1∶200稀释的P24单克隆抗等体积混合，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000），37℃孵育1h，洗涤，四甲基联苯胺显色，检测吸光度值。

2 结 果

2.1 重组质粒pET28a（＋）－p24片段的构建 应用PCR方法从HIV－1基因中获得p24基因片段，经内切酶、连接酶将其插入pET28a（＋）载体中，获得pET28a（＋）－p24重组质粒。构建的重组质粒pET28a（＋）－p24经BamHI／XhoI双酶切鉴定，得到693bp的目的条带，1%琼脂糖凝胶电泳结果与预期大小相同，见图1。DNA测序鉴定结果与本课题组设计的HIV－1 p24（hbx2）获取片段的核苷酸序列一致。

2.2 SDS－PAGE和 Western blot分析 将重组pET28a（＋）－P24质粒转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞内。1.0mmol／L IPTG 诱导4～6h后，表达蛋白经12%SDSPAGE。诱导后的菌液在相对分子质量约为26 000处出现明显目的条带，未经诱导的菌液无相应条带，见图2左。蛋白凝胶分析图表明pET28a（＋）－P24蛋白表达量约占全菌体总蛋白的19%。电泳分离的蛋白转印到硝基纤维膜条。以抗His标签抗体作为第一抗体，HRP标记的羊抗鼠抗体为第二抗体，对表达产物进行Western blot分析，得到的特异性蛋白的相对分子质量约为26 000，见图2右。

图1 重组质粒pET28a（＋）－p24的构建

2.3 P24单克隆抗体效价及其特异性 将纯化的P24蛋白包被于ELISA板，纯化后单克隆抗体进行梯度稀释，ELISA检测显示抗体效价最高可达到30万倍，具有较高的效价和良好的量效关系，见图3。阴性对照孔吸光度值为0.136。将IPTG诱导的P24菌、未诱导菌作为阴性对照组，His标签蛋白作为阳性对照的3个样品经SDS－PAGE，转印到硝基纤维膜条上，分别用P24单克隆抗体、His标签抗体及正常血清作为第一抗体，HRP标记的羊抗鼠抗体为第二抗体进行反应，结果显示P24单克隆抗体能够特异性结合P24蛋白，具有很好的特异性，见图4。

图2 HIV－1P24重组蛋白的鉴定

图3 HIV－1P24单克隆抗体的效价（ELISA）

2.4 ELISA法检测艾滋病患者血清的病毒载量 应用P24蛋白和制备的单克隆抗体建立竞争抑制ELISA法，首先建立标准曲线，其结果显示随P24蛋白浓度的增加其吸光值逐渐降低，二者呈高度负相关，r2＝0.971 7，见图5。应用建立的ELISA方法检测HIV－1阳性患者血清P24含量，并与逆转录PCR法检测的患者血清病毒载量进行相关性分析，结果表明ELISA的吸光值与病毒载量也呈高度负相关（r2＝0.847 7），这些结果提示制备的单克隆抗体能有效识别病毒P24抗原，见图6。

图4 HIV－1P24抗体的特异性（Western blot）

图5 HIV－1P24蛋白竞争抑制ELISA标准曲线

图6 病毒载量与P24吸光值的相关曲线（ELISA）

3 讨 论

目前临床可用于检测HIV感染并监测疾病进展的方法有HIV抗体检测、P24抗原检测、HIV核酸检测以及T淋巴细胞计数。总的来说，ELISA检测抗体和P24抗原的方法经济、省时。美国食品和药物管理局规定自1995年8月起，所有全血、成分血、白细胞和原料血清的献血员，在献血前必须进行HIV－1抗原的筛查。P24抗原更适合作为确定治疗开始时间以及治疗是否有效的标志物。美国艾滋病临床实验组认为，血清P24浓度下降一半表明抗病毒治疗有效，而P24浓度持续升高则表明缺乏有效治疗［10］。

P24蛋白作为结构基因gag的编码产物，其分子结构及其对机体的免疫作用机制已得到阐明，多种检测方法已用于临床，尤其是P24蛋白检测试剂盒已得到广泛应用，但由于其检出的假阳性率高，尚不能作为普查及评价艾滋病治疗效果的检测手段。本实验成功制备了P24抗原蛋白及其单克窿抗体，并对该抗体的效价及特异性进行了检验，结果显示制备的单克隆抗体具有很高的特异性，通过建立的ELISA竞争法检测HIV阳性的患者血清，并与检测的病毒载量进行相关性分析，证实二者具有显著相关性，表明本课题组建立的HIV检测法与PCR检测的效果相当，进一步说明制备的单克隆抗体特异性和敏感性较高，P24蛋白及相应的单克隆抗体可能为ELISA试剂盒检测艾滋病提供实验基础。

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