三氧化二砷逆转A549细胞对TRAIL耐药的研究＊

王绩英，赵雪强，王昌明，莫碧文，蒋 明，陈 峰

（桂林医学院附属医院呼吸内科，广西桂林541001）

在各种常见肿瘤中男性肺癌的发病率和死亡率最高，女性肺癌的发病率位居第4，死亡率位居第2。在中国，肺癌的发病率逐年上升［1］。由于大多数肺癌患者确诊时已属晚期，失去了手术机会，使放、化疗成为肺癌综合治疗的主要手段，但大多数肺癌患者对目前的常规化疗药物不敏感，因此，迫切需要寻求新的、更有效的化疗药物。肿瘤靶向治疗是以肿瘤细胞的某些关键蛋白作为靶点，特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有不良反应。在本研究中，将人非小细胞肺癌A549细胞用肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）、三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）处理，观察A549细胞的增殖与凋亡，以及TRAIL和As2O3对A549细胞核因子kappa B（nuclear factor－kappa B，NF－κB）、半胱－天冬 氨 酸 蛋 白 酶 （cysteinyl aspartate specific protease，caspase）－3、survivin mRNA 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 人非小细胞肺癌A549细胞为实验室自行传代保存。重组人TRAIL为以色列PROSPEC公司产品，As2O3注射液为哈尔滨伊达药业公司产品，Dulbecco′s改良Eagle培养（Dulbecco′s modified Eagle′medium，DMEM）、Trizol、AMV第一链cDNA合成试剂盒及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）System购自TAKARA公司。引物序列见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 细胞培养及分组 将A549细胞置于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素及100μg／mL链霉素的DMEM培养基中培养，待细胞处于对数生长期时将其分为对照组（仅加入DMEM）及实验组，实验组又分为As2O3（1μmol／L组As2O3处理）、TRAIL组（100μg／L TRAIL处理）及联合组（1μmol／L As2O3与100μg／L TRAIL联合处理）。

表1 PCR引物序列

1.3 四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法检测 将对数生长期的细胞以每孔200μL，2 000个／孔的细胞密度接种于96孔板，待细胞贴壁后按上述分组处理细胞，每组设3个复孔，同时设空白对照（仅加培养基）。培养24、48、72h后终止实验，每孔加5mg／mL MTT 20μL，继续培养4h，弃掉培养基，每孔加二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）200μL，震荡5min，使沉淀充分溶解。用酶标仪测490nm吸光度（absorbance，A）值。按公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）＝［（对照组A值－实验组A值）／对照组A值］×100%。

1.4 流式细胞仪检测 取对数生长期细胞接种于6孔板中，每孔4×104个细胞，培养12h后，用含0.5%胎牛血清的DMEM继续培养24h，使细胞周期同步化。按上述分组处理细胞，每组设3个复孔，培养48h后收集细胞，制成单细胞，70%冷乙醇固定，4℃过夜，检测前用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤，加入20μL核糖核酸酶A（RNaseA），37℃孵育30min，避光加碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，冰浴30min，以300目筛网过滤。调整细胞密度为1.0×106／mL后以流式细胞仪检测，激发光源为氩离子，激发波长488nm，用Multicycle DNA分析软件行细胞凋亡率测定。

1.5 逆转录－PCR（reverse transcriptase－PCR，RT－PCR）检测各组细胞于药物干预48h后提取总RNA。总RNA提取按TAKARA公司提供的试剂操作步骤操作。AMV第一链cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，再经PCR扩增。NF－κB扩增条件如下：94℃预变性3min后，94℃变性15s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。survivin扩增条件如下：94℃预变性3min后，94℃变性15s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。caspase－3扩增条件如下：94℃预变性3min后，94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统分析，计算相对表达量（与β－actin的比值）。

1.6 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量数据用±s表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 As2O3、TRAIL对A549细胞增殖的影响 As2O3组、TRAIL组A549细胞与对照组比较，细胞增殖的差异没有统计学意义。联合组A549细胞增殖作用明显强于As2O3组及TRAIL组，且具有时间依赖性（P＜0.05），见表2。

表2 As2O3及TRAIL对A549细胞的增殖抑制作用（±s，%，n＝3）

表2 As2O3及TRAIL对A549细胞的增殖抑制作用（±s，%，n＝3）

＊：P＜0.05，与As2O3组比较；△：P＜0.05，与TRAIL组比较。

组别细胞增殖抑制率24h 48h 72h As2O3组4.3±1.4 15.7±2.7 18.1±4.2 TRAIL组 3.8±1.7 12.8±2.0 15.2±4.2联合组 12.7±1.3＊△ 27.3±2.5＊△ 42.7±3.5＊△

2.2 As2O3、TRAIL对A549细胞凋亡的影响 凋亡的细胞通透性增加，细胞膜上会出现小漏洞，在洗涤和染色的过程中小片段DNA从细胞内丢失，使凋亡细胞的DNA含量低于正常细胞，在流式细胞仪DNA直方图上出现典型的亚二倍体凋亡峰。联合组 A549细胞的凋亡率为（28.73±1.55）%，而As2O3组和TRAIL组细胞凋亡率分别为（13.23±1.99）%和（5.92±2.48）%。联合组分别与As2O3组和TRAIL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 As2O3、TRAIL 对 A549 细 胞 NF－κB、survivin 及caspase－3mRNA表达的影响

2.3.1 As2O3、TRAIL对 A549细胞 NF－κB mRNA表达的影响 与对照组比较，经As2O3、TRAIL处理48h后，各实验组A549细胞 NF－κB mRNA 的表达下降，联合组细胞 NF－κB mRNA表达下降尤为明显（P＜0.01），见图1。

图1 对照组、TRAIL组、As2O3组及联合组A549细胞NF－κB mRNA 的表达

2.3.2 As2O3、TRAIL对 A549细胞survivin mRNA 表达的影响 与对照组比较，经As2O3、TRAIL处理48h后，各实验组A549细胞survivin mRNA的表达下降，联合组细胞survivin mRNA表达下降尤为明显（P＜0.01），见图2。

图2 对照组、TRAIL组、As2O3组及联合组A549细胞survivin mRNA的表达

2.3.3 As2O3、TRAIL对 A549细胞caspase－3mRNA表达的影响 各实验组A549细胞经As2O3、TRAIL处理48h后，与对照组比较，As2O3组A549细胞caspase－3mRNA的表达增强，TRAIL组A549细胞caspase－3mRNA的表达没有明显变化；与As2O3组和TRAIL组比较，联合组A549细胞caspase－3mRNA的表达明显增强（P＜0.01），见图3。

图3 对照组、TRAIL组、As2O3组及联合组A549细胞caspase－3mRNA的表达

3 讨 论

TRAIL是新发现的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成员，TRAIL通过与其受体［死亡受体（death receptor，DR）4、DR5］结合而启动死亡途径，激活Caspase级联反应，最终激活caspase－3发生生物效应，从而引发对TRAIL敏感的细胞大量、快速凋亡，而对机体正常组织不具有明显的毒性作用［2］。因此，TRAIL可能是一种很好的肿瘤靶向治疗药物。但近年来的研究发现，尽管TRAIL具有良好的特异性，仍面临抗肿瘤药普遍存在的耐药性问题，人们发现大部分肺癌细胞对TRAIL耐药，TRAIL的耐药机制目前仍不十分清楚［3－4］。作者推测化疗药物与TRAIL联用也许可逆转TRAIL的耐药性。As2O3是传统中药砒石的主要成分，是一种剧毒化合物。目前研究发现As2O3对急性早幼粒细胞性白血病具有诱导细胞凋亡的作用，并已在临床应用，同时，As2O3可逆转部分肿瘤细胞的耐药性。本实验通过流式细胞术检测发现TRAIL组的凋亡率仅有（5.92±2.48）%，而联合组的凋亡率为（28.73±1.55）%。

多药耐药（mutidrug resistance，MDR）是影响肿瘤化疗效果的重要原因。目前MDR的机制仍不完全清楚，人们认为由于 MDR1基因编码的跨膜 P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）、MRP1基因编码的跨膜糖蛋白使细胞内的药物排出或分布异常，使药物不能在细胞内达到有效浓度［5－6］。但这一机制还不能完全阐明 MDR。研究表明，MDR与细胞凋亡有关。Survivin是目前发现的较强的凋亡抑制蛋白，具有调控细胞增殖和凋亡作用，Survivin和肺癌的耐药性与疾病预后有关［7－9］。RT－PCR检测显示联合组A549细胞survivin mRNA的表达明显下降，而caspase－3mRNA的表达明显增强。

NF－κB具有显著抑制肿瘤细胞凋亡的功能，它与肿瘤的发生、生长和转移等多个环节密切相关。NF－κB的持续激活刺激细胞生长，导致细胞增殖失控［10］。但NF－κB的作用却有争议，Ehrhardt等［11］认为NF－κB在TRAIL凋亡信号转导过程中发挥负向调节作用，阻止细胞发生凋亡。Shetty等［12］则得出相反的结论，认为NF－κB促进TRAIL凋亡信号的发生，并认为NF－κB亚单位的种类及数量是这一作用的关键。有研究证实Survivin参与了 NF－κB介导的抗细胞凋亡全过程，存在NF－κB－Survivin途径［13－15］。

TRAIL与As2O3联用对A549细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡作用明显强于As2O3或TRAIL单独应用的作用。在联合组中可观察到细胞NF－κB mRNA的表达明显下降，这说明As2O3可能是通过NF－κB通路下调survivin mRNA，上调caspase－3mRNA的表达，从而解除survivin对caspase－3的抑制而逆转A549细胞对TRAIL的耐药性。As2O3能否在体内增强TRAIL的凋亡诱导作用，还有待进一步的研究。

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