改良琼脂培养基稀释法在抗真菌药物体外敏感性试验中的应用研究

陈思敏，何巧，谌立巍

随着时代的发展，严重的真菌感染逐渐增加。真菌感染、尤其是免疫力低下者机会性真菌感染发病率的不断上升，使真菌的治疗面临严峻考验。大量抗真菌药物的面世，对临床真菌感染性疾病的治疗带来了新的转机，同时关于耐药的报道也日益增多[1]。现阶段，中医药现代化的高速发展，涌现了一批很有代表性的抗真菌中成药及中药有效成分，如何对这类药物进行抗真菌体外敏感性评价，预测临床抗菌疗效就成为一个突出而迫切需要解决的问题。全世界多个实验室多以美国国家临床实验室（CLSI，前NCCLS）推荐的M27-A[2]方案和M38-A，采用液体培养基稀释法（包括试管法和微量法）对酵母菌和丝状真菌[3]进行抗真菌药物体外敏感性试验，取得了较好的一致性和稳定性。但是，对于中成药或中药提取物，其成分复杂，溶解性不理想，通过肉眼判断真菌是否生长不准确。因此在方法学上需要找到一种和CLSI方案一致，又适用于中药研究的体外敏感性试验方法。本研究采用CLSI M27-A2推荐的微量液体培养基稀释法和改良琼脂培养基稀释法同时测定20株临床近期分离无重复白色念珠菌对伊曲康唑的体外敏感性，初步比较两种方法的一致性，为建立实用性更强、直观、简便、快捷的抗真菌体外药物敏感性试验方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

1.1.1 临床分离菌株 均为2012年7月～2012年8月从四川省内三级甲等医院住院患者体内分离的无重复临床致病白色念珠菌，标本主要由皮肤、生殖系统等感染病患者的分泌物临床标本中分离。所有分离菌株经分离单位鉴定，并含有一定比例耐药菌株。1.1.2 标准质控菌株 白色念珠菌ATCC 90029，平滑念珠菌ATCC 22019均由中国国家菌种库购买。

1.2 供试药物

伊曲康唑，批号：20111101，成都倍特药业有限公司生产，由四川省医药有限公司提供。

1.3 试验试剂

RPMI-1640液体培养基（GIBCO公司生产，批号31800-022），沙氏培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司生产，批号20120818），固体琼脂粉（成都市科龙化工试剂厂，批号20120301），葡萄糖（成都市科龙化工试剂厂，批号20120331）。

1.4 方法

1.4.1 液体培养基稀释法（微量法）受试菌液的配制 所有受试菌株，均由甘油保存于－20℃。实验前接种于改良沙氏琼脂培养基平皿上复苏，于35℃培养7天后，传代一次受试。取新鲜沙氏培养基上的单一菌落3～5个，用5mL生理盐水配置为0.5麦氏浓度（1～5×106CFU﹒mL-1），并用RPMI-1640液体培养基稀释1000倍为1～5×103CFU﹒mL-1菌悬液备用。受试药物配制 采用培养基对倍稀释方案，将药物伊曲康唑溶于RPMI-1640液体培养基中，对倍稀释，使伊曲康唑终浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μg﹒mL-1。加药方案 将受试药液按浓度差异分别加入U形96孔板中，每孔加入100 μL药液。而后加药孔菌加入对应20株不同菌种的100 μL菌悬液，使每孔菌浓度均保持在0.5～2.5×103CFU﹒mL-1。试验结果判定 96孔板于35℃ 孵育培养48 h后，与空白对照组进行比较，以肉眼澄清为标准，以溶液澄清的最低药物剂量为该药物对该受试菌的最小抑菌浓度MIC值。质控菌白色念珠菌ATCC 90029、平滑念珠菌ATCC 22019跟随每批实验。

1.4.2 改良琼脂培养基稀释法

1.4.2.1 受试菌液的配制同液体培养基稀释法项下加药方案及结果判定 将伊曲康唑用无菌水倍比稀释为10个浓度，分别精密量取1mL药液与加热溶解的14mL含2%葡萄糖的RPMI-1640固体培养基（每L培养基中已经加入消毒灭菌的12.5 g固体琼脂粉，并充分溶解）充分混合，加入到90 mm的一次性消毒培养皿中，保持培养皿中所含抗菌药的最终稀释浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μg﹒mL-1。待培养基冷却凝固后，吸取20株菌株的菌悬液5 μL分别接种于含药培养皿中，35℃条件下于孵箱中培养48小时，以肉眼未见真菌菌团生长的最低药物浓度为 MIC。质控菌白色念珠菌ATCC 90029、平滑念珠菌ATCC 22019跟随每批实验。

1.5 数据分析

记录每一株真菌的MIC值，以50%真菌MIC值为MIC50，以90%真菌MIC值为MIC90，以最小MIC值与最大MIC值之间的范围为MIC range，并比较两种试验方法下，20株白色念珠菌对伊曲康唑敏感性的差异。

2 结果

两种体外抗真菌敏感性试验结果见表1。

表1 两种体外抗真菌敏感性试验结果

结果显示，两种方法所测得的MIC具有一致性。

3 讨论

随着社会的发展以及医疗水平的提高，移植、肿瘤和免疫缺陷患者的增多，侵袭性真菌感染（Invasive fungal infections ，IFI）病例也明显增加。近年来有多种新型抗真菌药物投入临床，临床真菌耐药性也随之出现。现已有报道，有多种中药及提取物具有抗真菌的作用[4]。说明中药抗真菌药物的研发具有很大的优势和潜力。但是由于中药单体或复方的特殊性，如成分复杂、溶解度差，并且往往带有较深的颜色，所以传统的抗真菌药物敏感性试验方法和标准已难以满足中药抗真菌药物的研究。本试验就是在原有的抗真菌试验基础上进行改良，采用固体培养基进行试验。此种方法不但可以在短期内通过观测可视菌落的生长判定药物的MIC值，同时还避免了由于药物本身原因造成的肉眼MIC值判定的误差，具有实用性。本试验以常用抗真菌药伊曲康唑为载体，采用两种方法观测其近期临床分离白色念珠菌的药物敏感性，两种方法所得结果具有一致性，结果初步显示改良琼脂培养基稀释法有可能成为一种评价抗真菌药物体外敏感性的一种直观、简单、快速的方法。

[1] 刘锦燕.抗真菌药物敏感性试验方法研究进展[J].检验医学,2009,24(12):927.

[2] National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved standard M27-A.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997:1.

[3] 李厚敏,刘伟,李若瑜.美国临床实验室标准化委员会2003年版产孢丝状真菌药敏试验方案简介[J].中华检验医学杂志,2005,28(1):121.

[4] 王刚生,邓洁华.桂皮油藿香油复合物对曲霉菌活性及机理的研究[J].时珍国医国药,2010,23(6):1426.