沙门氏菌的热裂解气相色谱-质谱分析

2012-10-08董海燕施点望

质量技术监督研究 2012年1期

董海燕，施点望，卫敏

(福建省纤维检验局，福建福州，350026)

沙门氏菌是属肠杆菌科的重要病原菌属，有史以来，沙门氏菌都是食品行业的重要检测指标。而对于纺织行业，沙门氏菌是羽绒及其羽绒制品的必检指标[1]，检测周期很长，一般为5～7d[2-3]，过程相当繁琐，尤其是过滤过程，相当耗时，难以适应市场检验中快速、简便、精准的要求。因此寻求一种较为实际的快速检测方法具有重要现实意义和理论价值，值得研究。

Py-GC-MS技术具有简便、快速、灵敏和可重复性强等优点，它已日益广泛地应用于检出和鉴别微生物[4-5]。本研究利用Py-GC-MS技术对沙门氏菌全细胞进行了条件分析，确定了适合进行沙门氏菌的Py-GC-MS的条件以及部分裂解产物的结构，从而为快速鉴定沙门氏菌提供一种新方法，缩短羽绒中沙门氏菌的检测周期，为羽绒检测标准的实施和修正提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi A），菌株编号：CMCC（B）50093，购自广东环凯微生物科技有限公司，产品批号：10072104B。

1.2 试验试剂

营养肉汤培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；37%甲醛溶液（福尔马林）为分析纯；无菌水，本试验室自制。

1.3 仪器设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；PY-2020is热裂解仪，安捷伦；G1888-7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪，安捷伦；FD-1-50真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；KA-1000台式离心机，上海安亭科学仪器厂；BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜，苏州净化设备有限公司；ZHWY-100B型恒温振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；VDRTEX-5混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.4 菌体制备

1.4.1 接种菌液和培养

用1mL营养肉汤，将冻干粉菌种制成菌液。然后取0.1mL菌液接种至10mL营养肉汤培养基中，置37℃培养箱中，100转/min，振荡培养24h。再取1mL菌液接入100mL营养肉汤中，继续置37℃培养箱中，100转/min，振荡培养24h。

1.4.2 灭活和收集

将1mL的37%甲醛溶液加入到100mL的培养液中将其灭活。灭活后的培养液，经4000转/min离心数次后，收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤2次后，再加入0.1mL的无菌水，旋涡振荡后分装至样瓶。

1.4.3 预冷和冻干

将分装好的菌体，置于-20℃冰箱，冷冻24h后，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥成粉状后保存备用。

1.5 热裂解气相色谱-质谱条件

1.5.1 裂解条件

裂解温度650℃，时间为12s，表面温度280℃，进样量：0.2mg。

1.5.2 气相色谱条件

色谱柱（DB-17MS，30m×0.25mm）；升温程序：起始温度44℃（2min），采用5℃/min的速率上升至200℃（8min），然后300℃后运行2min；分流比为1：50；载气为氦气。

1.5.3 质谱条件

离子源温度230℃，传输线温度280℃，电离方式EI，电离电压为69eV，质谱数据库为安捷伦公司数据库。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌热裂解气相色谱图

沙门氏菌全细胞经650℃热裂解，裂解产物为多种低分子质量物质，在优化后的气相色谱-质谱条件下，可得到清晰的总离子流色谱图，并对主要热裂解产物对应的色谱峰进行了数字标识，色谱峰号分别是：1#-10#，如图1所示。

2.2 沙门氏菌热裂解产物分析

沙门氏菌全细胞在650℃裂解时，裂解产物经气相色谱分离后，再由质谱系统进行分析，谱图经仪器自带谱库检索，由人工解析，对主要的10种裂解产物进行了结构鉴定，结果见表1。结果表明：热裂解产物分为四大类，其中，第一类：脂肪族裂解产物，主要以二氧化碳为代表，该类物质是沙门氏菌全细胞高度裂解的产物，其产率最高；第二类：芳香族裂解产物，以甲苯、苯酚、对甲苯酚、苯乙腈等为代表，该类物质的主要特征是含有苯环；第三类：烯类裂解产物，其代表物质是1-十三烯；第四类：杂环类裂解产物，其代表物质是：腺嘌呤、2-呋喃甲醇。

2.3 沙门氏菌热裂解产物化学结构分析

沙门氏菌全细胞经热裂解后，10种主要产物的化学结构式及其对应的CAS#如表2所示。经理论分析，沙门氏菌属肠科细菌，是一类单细胞物质，其构架组成主要为肽聚糖（由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替相连而形成的多糖链）、脂类、蛋白质（由氨基酸组成）、DNA（脱氧核糖核酸，组成单位是核苷酸，而糖类与磷酸分子由酯键相连，组成其长链骨架）和RNA（核糖核酸，由核苷酸单元长链组成，每个单元含有一个含氮碱基、一个核糖苷和一个磷酸基）[6-7]。经分析沙门氏菌全细胞组成物质的化学结构和表2中沙门氏菌热裂解产物的化学结构，结果表明：裂解产物一部分是由于高温而产生的炭化产物（比如：二氧化碳），一部分是由于高温造成分子之间连接键的断裂而形成的单一结构（比如：嘌呤、吲哚等物质）。

2.4 沙门氏菌部分热裂解产物质谱分析

沙门氏菌全细胞经650℃热裂解，形成的裂解产物经色谱分离后，用质谱系统进行分析。根据裂解产物的离子碎片信息，经安捷伦化学物质谱库检索进行定性鉴定，确认了大部分裂解产物的化学结构，其匹配度较高；但由于匹配度较低而存在小部分裂解产物的结构无法确定。其中图1中2#峰上的2个质谱图如图2和图3所示；图1中10#峰上的2个质谱图如图4和图5所示。结果表明：2#对应的2个质谱图的m/z极其一致；且10#峰对应的质谱图m/z也极其一致，这说明图1总离子流色谱图中的峰纯度很高。