哮喘小鼠肺和下丘脑组织中γ-氨基丁酸受体ARα的表达

朱亚蕊，刘剑波

郑州大学第二附属医院呼吸内科 郑州 450014

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是哺乳动物重要的抑制性神经递质之一，在中枢神经系统分布广泛，也存在于气道平滑肌细胞及气道上皮细胞等周围组织[1]。根据受体对激动剂和拮抗剂的敏感性，GABA受体可以分成 GABAAR、GABABR和GABACR 3种。GABAAR属受体门控离子受体超家族，α亚单位在GABAAR复合物的组装和功能中可能起主要作用[2]。GABAAR和GABA合成酶(GAD65/67)在支气管上皮细胞中均有表达，组成了完善的GABA系统。已有研究[3-4]表明，过敏性哮喘时GABA系统功能增强，雾化吸入GABAAR拮抗剂可抑制哮喘气道黏液分泌，抑制气道重塑。气道杯状细胞增生是哮喘的主要病理特征，MUC5AC是在气道杯状细胞表达的一种主要黏蛋白，反映了气道黏液分泌情况[5]。作者对哮喘小鼠肺组织和下丘脑内GABAARα、肺组织中MUC5AC进行了检测，旨在从分子水平探讨哮喘小鼠肺和脑组织中GABAARα的变化及其与气道黏液分泌的关系。

1 材料与方法

1.1 实验分组 6周龄清洁级雌性BALB/C小鼠30只，购于河南省实验动物中心，体质量(20±2)g，按随机数字表法分为3组，对照组、哮喘组、地塞米松组，每组10只。实验第1天和第8天，哮喘组和地塞米松组小鼠腹腔注射卵蛋白(OVA)/Al(OH)3混合液 1 mL(含 OVA 1 mg和 Al(OH)3100 mg，OVA购于Sigma公司)致敏，从实验第15天开始以用10 g/L OVA雾化吸入30 min/d激发，连续7 d。对照组致敏与激发均以生理盐水代替，地塞米松组在激发前腹腔注射地塞米松1 mg/kg。

1.2 标本的采集和处理 末次激发后24 h，水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将生理盐水注入右心室冲洗2次以洗尽肺和脑内血液。暴露胸腔，切取左肺叶近肺门组织，多聚甲醛固定5～6 h后，转入体积分数70%乙醇，常规石蜡包埋切片备用。切取右肺叶迅速放入液氮中，速冻后转移至－80℃保存备用。打开颅腔，迅速取出全脑组织置于冰台上，分离出下丘脑，一侧放入甲醛，一侧速冻后放入－80℃冰箱保存备用。

1.3 肺组织病理学观察 取肺组织切片，常规HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性粒细胞浸润情况。

1.4 肺组织糖原(PAS)染色观察 将肺组织切片放入高碘酸水溶液氧化5 min，蒸馏水浸洗后在Schiff液中浸泡10～20 min，蒸馏水洗后用无水乙醇脱水，中性树脂封片，观察。

1.5 肺组织和下丘脑组织中GABAARα mRNA、肺组织中MUC5AC mRNA的检测 根据GenBank中GABAARα、MUC5AC和GAPDH的基因序列设计引物。MUC5AC引物序列:上游 5’-CAGCCGAG GAGGGTTTGATCT-3’，下 游 5’-AGTCTCTCTC CGCTCCTCTCAAT-3’，扩增产物大小 349bp。GABAARα 引物序列:上游 5’-TGGGAAGAA CAAATCTGTGG-3’，下 游 5’ -GTAGCCTTGGGT GAAGCAAT-3’，扩增产物大小636 bp。GAPDH引物序列:上游 5’-TCTTGGGCTACACTGAGGAC-3’，下游 5’-CATACCAGGAAATGAGCTTGA-3’，扩增产物大小126 bp。取约100 mg组织标本加液氮研磨后加入1 μL Trizol试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，参照说明提取总RNA，取4 μL逆转录合成cDNA。以2 μL cDNA为模板，行PCR扩增。扩增条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，53℃(GABAARα和GAPDH)或52℃(MUC5AC)退火30 s，72℃延伸2 min，共30个循环;72℃总延伸6 min。取5 μL扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶显色，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析。以目的基因和β-actin扩增条带的灰度值之比表示目的基因mRNA的相对表达量。

1.6 肺和下丘脑组织中GABAARα蛋白的检测采用免疫组化SP法。小鼠抗GABAARα单克隆抗体(按50倍稀释)购自北京博奥森生物技术有限公司，SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术服务有限公司。切片常规脱蜡水化，微波抗原修复，用体积分数3%H2O2除去内源性氧化酶，余步骤按试剂盒说明书进行。GABAARα蛋白染色阳性信号为棕黄色颗粒。用彩色图像分析系统测定5个200倍视野的光密度，取其平均值，表示目的蛋白表达强度。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析。3组肺和下丘脑组织中GABAARα蛋白和mRNA的表达量、肺组织中MUC5AC mRNA表达量的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，哮喘组肺与下丘脑组织中GABAARα mRNA表达、GABAARα蛋白表达及肺组织中GABAARα与MUC5AC mRNA表达的关系分析采用Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组小鼠肺组织病理学表现 对照组小鼠气道黏膜正常，气道周围无炎性细胞浸润，肺泡壁结构完整;哮喘组小鼠气道黏膜充血水肿，黏膜层增厚，支气管壁及血管壁周围有较多炎症细胞浸润;地塞米松组黏膜水肿及炎症细胞浸润较哮喘组减轻。见图1。

图1 3组小鼠肺组织病理学表现(HE，×200)

2.2 3组小鼠气道PAS染色情况 对照组可见气管及各级支气管黏膜纤毛柱状上皮细胞形态完整，在纤毛间极少见杯状细胞，肺泡大小正常。哮喘组、地塞米松组支气管、亚段支气管、细支气管管壁可见大量染成紫红色的杯状细胞;支气管黏膜上皮局部剥脱，黏膜下明显水肿;黏膜层、黏膜下层及肌层有嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润;支气管管腔内分泌物增加，部分可见淋巴细胞。地塞米松组上述表现较哮喘组明显减轻。见图2。

2.3 3 组小鼠肺组织中 GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白的表达 见图3和图4。肺组织中GABAARα蛋白主要表达于气道上皮，在基底部无表达，阳性表达产物定位于细胞膜。哮喘组小鼠肺组织 GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白表达量较对照组增高，地塞米松组 较哮喘组明显降低，但仍高于对照组(表1)。

表1 3组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白的表达

2.4 3组小鼠下丘脑组织中GABAARα mRNA和蛋白的表达 见图3和图5。GABAARα蛋白在下丘脑组织中主要表达于神经元胞质、胞膜和凸起，胞核无染色。哮喘组小鼠下丘脑组织中GABAARα mRNA和蛋白的表达较对照组明显增高。地塞米松组小鼠下丘脑组织中GABAARα mRNA和蛋白的表达较哮喘组降低，但与对照组比较，两者的表达水平仍较高(表2)。

图5 3组小鼠下丘脑GABAARα蛋白的表达(SP，×200)

表2 3组小鼠下丘脑GABAARα mRNA和蛋白的表达

2.5 哮喘组小鼠各指标之间相关性分析 哮喘组小鼠肺组织GABAARα与MUC5AC mRNA的相对表达量呈正相关(r为 0.814，P=0.004)。哮喘组小鼠下丘脑与肺组织中GABAARα mRNA的相对表达量、蛋白表达水平均呈正相关(r分别为0.740、0.791，P 分别为 0.014、0.006)。

3 讨论

过敏性哮喘是有多种细胞和细胞成分参与的气道慢性炎症，发病机制不完全清楚。中枢神经系统在哮喘发作中发挥重要作用，有学者[6]提出了哮喘发病的中枢致敏机制及中枢免疫调节机制。下丘脑是边缘系统的重要核团，是免疫和应激反应的重要整合中枢[7]，可直接或间接参与气道张力和过敏反应的调控[8]。作者观察到，哮喘小鼠下丘脑GABAARα蛋白表达增强，这就增加了GABA与其受体结合的机会，增强了GABA的抑制作用，表明GABA可能是参与哮喘病理生理过程的重要中枢性神经递质之一，进一步证实中枢神经系统在哮喘病理生理过程中发挥作用。哮喘小鼠脑组织中GABA受体增加的机制可能是:由于血清中增高的IL-13、IgE、IL-5等炎症因子通过血脑屏障到达中枢系统，或通过哮喘激发时由于缺氧或紧张导致神经兴奋上传到中枢，使中枢神经系统炎症因子增多，导致GABA受体增加。哮喘发作时机体处于一种应激状态，下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)兴奋，大脑兴奋性神经递质大量释放，为平衡兴奋性神经递质，抑制性神经递质GABA释放亦增多，GABA受体表达上调是一种中枢神经保护机制。

气道黏液过度分泌是重症哮喘的特征之一。研究[9]表明 GABA系统和黏液分泌关系密切，阻断GABAAR后能够抑制哮喘急性发作期的黏液分泌和杯状细胞增生。该研究结果表明，过敏性哮喘小鼠被OVA激发后气道上皮细胞GABAAR mRNA表达增多，气道杯状细胞增生，MUC5AC mRNA表达亦增强，两者具有相关性。研究[10]证实，GABAAR的运输及细胞表面靶作用由PI3K调节，其可被不同的信号活化，包括胰岛素、生长因子及白介素。哮喘患者T细胞可产生大量白介素如IL-4、IL-13、IL-5、IL-10等，这些白介素可能通过活化上皮细胞的PI3K/Akt通路激发神经元细胞后突触区GABAAR[11]，通过 GABA 引起气道黏液的大量分泌。

作者还观察到，地塞米松组小鼠肺和脑组织中GABAARα、肺组织中MUC5AC的表达均较哮喘组低，说明地塞米松治疗哮喘的机制包括抑制炎症因子释放，下调肺组织和脑组织GABA受体的表达，减轻黏蛋白的分泌。哮喘小鼠下丘脑与肺组织中GABAARα的表达均呈正相关，提示GABA系统可能与哮喘的中枢神经调节有关，但肺和脑组织中GABA的具体信号传导机制及脑内其他神经递质的变化还有待进一步研究。

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