油茶饼粕多糖对体外α－葡萄糖苷酶的抑制作用 ＊

李湘洲，张 胜，李文生，2

（1.中南林业科技大学 材料科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.湖南大学 化学化工学院，湖南 长沙 410082）

糖尿病的发生主要是因为血糖的来源与利用之间的动态平衡被破坏.多糖通过调节生物体内糖代谢酶来调节血糖水平，并通过抗氧化作用对血糖进行调节［1－2］.糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种综合病症.主要是由于体内胰岛素相对或绝对不足所引起的糖代谢紊乱所致.糖尿病患者长期处于高血糖状态会引起失明、肢体坏死等并发症［3］.有研究表明茶多糖有较强的降血糖功能［4－5］.而对油茶饼粕多糖在此方面的研究少有报道.

油茶饼粕多糖，是指山茶科山茶属油茶（Camellia oleifera Abel.）经过压榨制油后的种籽中所含的杂多糖类成分.油茶是我国特有的木本油料，据《全国油茶产业发展规划（2009－2020）》统计，我国现有油茶林面积302×104hm2，年产油茶饼粕68.39万吨.油茶籽在榨油后形成的饼粕，通常用于提取茶皂素.而据报道，榨油后的油茶籽饼粕中化学成分组成是：脂肪8.73%，水分1.52%，粗蛋白5.85%，皂 素 30.34%，总 糖 50.52%，灰 分2.95%［6］.因此对糖类化学成分的研发对于延长油茶产业链、增加副产物的附加值具有重要意义.

由于天然α－葡萄糖苷酶抑制剂在糖尿病饮食疗法中具有重要作用，因此研究天然α－葡萄糖苷酶抑制剂的来源及应用十分必要［7］.α－葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型常用于降血糖药物的体外筛选［8］.α－葡萄糖苷酶是一种存在于小肠黏膜细胞刷状缘的糖苷代谢酶，该酶针对双糖发挥水解作用，使进入小肠的碳水化合物最终形成单糖，被机体吸收.因此，通过观测α－葡萄糖苷酶活性的变化情况，可获得药物抑制血糖的效果.与动物模型实验比较，这是一种操作性强且高效的实验方法.

本文研究油茶饼粕多糖对体外α－葡萄糖苷酶抑制作用.首先测定了各分级多糖的相对分子质量.采取PMP柱前衍生高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成.然后通过测定底物（蔗糖）在α－葡萄糖苷酶作用下生成葡萄糖量，计算样品对α－葡萄糖苷酶的抑制率.

1 实验部分

1.1 实验材料

油茶饼粕：品种为普通油茶（Camellia oleifera），采集于湖南省株洲县，采集时间为2009年10月.经机械压榨后的干燥饼状物即为油茶饼粕.

1.2 试剂与仪器

葡萄糖试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号为112571；蔗糖：天津科密欧化学试剂有限公司，批号为1003042，用去离子水配制成30 mmol／mL作为底物溶液；阿卡波糖（Acarbose）：中国药品生物制品检定所，批号为100808－2009202；PBS缓冲盐：天津津脉公司生产，出厂代码为JMF－0006；生理盐水：湖南科伦制药有限公司生产，批号为091103503；DEAE－52纤维素：北京瑞达恒辉科技发展有限公司；其他试剂为分析纯.

酶标仪：Thermo公司，型号Multiskan Ascent，96孔板；大鼠，SD雄性，体重230～270g.

1.3 试验方法

1.3.1 油茶饼粕多糖的制备及相对分子质量测定

油茶饼粕多糖：油茶饼粕经脱脂、水提取、脱蛋白、乙醇沉淀后冻干获得油茶饼粕粗多糖（CCP）.粗多糖上DEAE－52纤维素层析柱，先后采用去离子水，0.1mol／mL，0.2mol／mL，0.5mol／mL氯化钠溶液及0.5mol／mL氢氧化钠溶液洗脱，分别收集洗脱液后减压浓缩，透析后冷冻干燥，获得分级多糖.以已知系列相对分子质量葡聚糖为对照品，采用高效凝胶色谱法（HPGPC）测定各分级多糖的相对分子质量.采取PMP柱前衍生高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成［9］.

1.3.2 α－葡萄糖苷酶抑制活性测定

α－葡萄糖苷酶从大鼠肠黏膜内提取，于－20℃保存备用.实验分为空白组、不加抑制剂的阴性组、阿卡波糖阳性对照组和待测样品组.酶液、阿卡波糖、油茶饼粕多糖样品分别用PBS缓冲液溶解稀释.在酶标仪96孔板中，依次加入如表1所示的各种试剂，经过酶液与反应底物剂量预试后，最终反应体积50μL，置于37℃恒温箱保温20min.

按葡萄糖试剂盒使用的要求，在50μL测量液中再加入1 500μL酚试剂（试剂盒自带），混合均匀，于37℃保温20min，以空白管调零，在492nm处测吸光值，吸光值与葡萄糖生成量呈线性相关.根据测定结果计算IC50（即抑制酶活性达到50%时所需要抑制剂的浓度）.

抑制百分率IR＝（A测试－A样品－A空白）／（A测试－A空白）×100%.

表1 各实验组的溶液配制Tab.1 Reagents in each experimental groupμL

2 结果与讨论

2.1 多糖纯化与相对分子质量测试的结果

经过DEAE－52纤维素柱层析对粗多糖样品的分离，不同溶剂洗脱后获得的5个分级多糖.分别命名为CCP1，CCP2，CCP3，CCP4和CCP5.采用高效凝胶色谱法，以系列已知相对分子质量的葡聚糖为标准品，测定油茶饼粕多糖相对分子质量，结果见表2.

表2 各样品相对分子质量测试结果Tab.2 Assay results of relative molecular mass

采取PMP柱前衍生高效液相色谱法测得油茶饼粕多糖中单糖组成比例为：阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶甘露糖＝1∶0.367∶0.181∶0.126∶0.054∶0.037 3.

2.2 油茶饼粕多糖对大鼠小肠黏膜α－葡萄糖苷酶抑制效果测定与分析

从图1可知，油茶饼粕粗多糖及各分级多糖的不同质量浓度与其对α－葡萄糖苷酶的抑制活性呈现正相关，IC50值见表3.说明油茶饼粕多糖对α－葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，且纯化分级以后大部分分级多糖抑制效果较粗多糖更显著.说明分级纯化是必要的.这也表明油茶饼粕多糖具有一定的抑制糖吸收的功能，即可能具有一定的降血糖活性.结合表2结果分析：多糖的相对分子质量为3 000～12 000，与已报道的其他物种中有较强活性多糖的相对分子质量类似，证明具有活性的多糖相对分子质量通常是较低的.由单糖组成分析结果可知油茶饼粕多糖的单糖构成中阿拉伯糖比例最高，而阿拉伯糖是一种常见的抑制血糖升高的成分.因此，可推测油茶饼粕多糖对α－葡萄糖苷酶活性的抑制与此有密切关系.

图1 不同样品对α－葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory activity curve of CCP onα－glucosidase

表3 不同油茶饼粕多糖样品的IC50Tab.3 Results of IC50

2.3 结果与讨论

油茶饼粕多糖中单糖组成比例为：阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶甘露糖＝1∶0.367∶0.181∶0.126∶0.054∶0.037 3.由单糖组成分析结果可知油茶饼粕多糖的单糖构成中阿拉伯糖比例最高，而阿拉伯糖是一种常见的抑制血糖升高的成分.因此，可推测油茶饼粕多糖对α－葡萄糖苷酶活性抑制与此有密切关系.

经体外活性检测证实了油茶饼粕多糖具有抑制葡萄糖吸收的作用.油茶饼粕粗多糖及各分级多糖的不同质量浓度与其对α－葡萄糖苷酶的抑制活性呈现正相关.纯化分级以后的多糖抑制效果较粗多糖更显著.

活性多糖的降血糖机制是多途径、多靶点的，作者下一步将对油茶饼粕多糖降血糖的构效关系以及机制开展研究.

致谢：感谢江南大学分析测试中心为本文多糖相对分子质量及单糖组成的检测提供条件.

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