血必净对大鼠急性肺损伤后肺纤维化的干预效应研究

梁子敬 汪友平 赖荣德

【摘要】目的 探讨血必净对油酸诱导大鼠急性肺损伤后肺纤维化的影响。方法 雄性SPF级Wistar大鼠60只，随机（随机数字法）分为3组（n=20）：A组注射生理盐水作为健康对照组；B、C两组所有大鼠均用油酸复制急性肺损伤模型，B组为模型对照组，C组在模型基础上加用血必净为干预组。3组均于注射后12 h抽动脉血作血气分析测定血氧分压，以氧合指数≤300为造模成功。确定模型成功后，A、B两组经尾静脉注射生理盐水（4 ml/kg），C组经尾静脉给予血必净（4 ml/kg），每天1次，连续给药7 d。各组于给药后24 h、7 d、14 d和28 d各处死5只大鼠，取心脏血后处死大鼠，左肺称湿质量后行支气管肺泡灌洗，灌洗后烘干称质量，酶联免疫法（ELISA）检测血清和支气管肺泡灌洗液Ⅲ前胶原（PCⅢ）浓度，取右肺上叶行肺组织病理学检查，经石蜡包埋切片后分别行苏木素-伊红（HE）染色和Masson染色。各组间比较采用单因素方差分析，均数间差别多重比较采用SNK-q检验；非正态分布或方差不齐采用秩和检验。所有数据均用SPSS 13.0 统计软件包进行统计处理。结果 B、C两组氧合指数（PaO₂/FiO₂）＜300，与A组比较明显下降(P＜0.05)；与A组相比，B、C组在7、14、28 d 3个时点血清和支气管肺泡灌洗液中Ⅲ前胶原蛋白的浓度增高（P＜0.01）, C组与B组相比在14 d和28 d两时点血清PCⅢ浓度降低（P＜0.05），C组在7、1d和28 d时点支气管肺泡灌洗中Ⅲ前胶原蛋白的浓度比同时段的B组降低（P＜0.01）。结论 血必净可能通过抑制急性肺损伤后肺纤维化而有助于损伤肺保护。

【关键词】急性肺损伤；急性呼吸窘迫综合征；肺纤维化；血必净注射液；油酸；Ⅲ前胶原蛋白；HE染色；Masson 染色

Effect of Xuebijing on lung fibrosis in a rat model of oleic acid-induced lung injury LIANG Zi-jing, WANG You-ping, LAI Rong-de. Emergency Department,The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120,China

Corresponding author: LIANG Zi-jing, Email: liang-zj-doctor@163.com

【Abstract】Objective To investigate the effect of Xuebijing (Chinese herbal medicine preparation) on lung fibrosis in a rat model of oleic acid-induced lung injury. Methods Sixty SPF level of male Wistar rats were randomly (random number) divided into three groups (n= 20): normal control group (group A)，oleic acid model group (group B)，oleic acid and Xuebijing group (group C). Rats in group A were injected with normal saline (0.13 ml/kg); acute lung injury (ALI) model rats were injected with oleic acid (0.13 ml/kg) intravenously in B and C groups. Twelve hours after administrations of saline or oleic acid into rats of three groups separately, samples of arterial blood from all rats were taken for blood gas analysis. By analysis of blood oxygen partial pressure, the acute lung injury model successfully made was confirmed. Then the rats in group C were treated with xuebijing (4 ml/kg) intravenously, once a day from the 1st to 7th day. The rats in groups A and B were treated with saline (4 ml/kg). Five rats in each group were randomly sacrificed on the 1st ，7th，14th，28th day, separately. The bronchoalveolar lavage (BAL) of left lung of all rats was carried out after weight of lung weighed．The left lungs of rats were weighed in wet and dry in order to get the wet/dry ratio. Venous blood and BAL fluid (BALF) were obtained for detection of procollagen Ⅲ (PCⅢ) concentrations with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Right upper lobe of lung specimens was taken for histopathological examination after paraffin-embedded sections with hematoxylin-eosin ( HE) staining and Masson staining . Multiple comparisons were analyzed by using one-way analysis of variance (SNK-q test). Statistical analyses were performed by using SPSS 13.0 software. Results Oxygenation index of groups B and C (PaO₂/FiO₂<300) significantly decreased compared with the group A (P<0.01). Levels of serum PCⅢ on the 14th day and 28th day in group C decreased significantly in comparison with group B (P<0.05). Compared with group A, the levels of BALF PCⅢ and serum PCⅢ in group B and group C on the 7th day, 14th day and 28th day increased (P<0.01). Levels of PCⅢ in BALF on the 7th day, 14th day and 28th day in C group decreased in comparison with group B (P<0.01). Compared with group A, the levels of PCⅢ in BALF in group B and group C on the 7th day, 14th day and 28th day increased (P<0.05).Conclusions The result suggests that treatment with xuebijing may be useful in inhibiting pulmonary fibrosis during the course of ALI in rats.

【Key words】Acute lung injury; Acute respiratory distress syndrome; Pulmonary fibrosis; Xuebijing; Oleic acid; Ⅲ procollagen; HE staining; Masson staining

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是临床常见的急重症，急性呼吸窘迫综合征( acute respiratory distress syndrome，ARDS)为ALI的严重阶段。持续急性呼吸窘迫综合征是以肺纤维化增强，进行性的炎症、长时间的机械通气和高病死率为特征，肺损伤后肺纤维化可能是影响患者生存质量的重要因素。近年来的研究提示在ALI的早期即可出现成纤维细胞增生和胶原分泌增强，Marshall等^［1］发现在ALI的严重阶段ARDS发病24 h内血清和支气管肺泡灌洗液中Ⅲ型前胶原质量浓度在死亡患者中更高。迄今为止，已发现有14种不同类型的胶原，主要是I型和Ⅲ型胶原(其前身为PCⅢ)；细胞外基质的沉积增多主要是胶原蛋白的增加。通过检测反映肺纤维化指标的PCⅢ可以从一定程度上了解到肺纤维化肺内胶原沉积及其血中胶原含量的变化趋势^［2］。有研究发现复方中药制剂血必净对急性肺损伤和肺纤维化治疗可能有益^［3-4］，为此本研究使用血必净对油酸至ALI模型进行干预，探讨其可能的作用机制和疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物及器材

1.1.1 实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，体质量(226±10)g(购自中山大学动物实验中心) 实验动物质量合格证书：SCXK(粤)2009-0011。实验场地：广州呼吸病研究所国家重点实验室，动物实验设施使用许可证号：SYXK（粤）2009-0093。

1.1.2 实验器材 血必净注射液（天津红日药业有限公司，批准文号：Z20040033）;10%中性福尔马林（广州化学试剂厂）；大鼠羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠PCIII测试盒（B＆G，上海蓝基生物公司，批号:E02P0047）；血气分析仪及试纸（美国ABBOTT公司）；油酸（广东汕头化学品厂）。

1.2实验方法

1.2.1 实验动物分组 60只SPF级Wistar大鼠随机（随机数字法）分为A、B、C三组：A组20只为健康对照组，B组20只为ALI模型组，C组20只为治疗干预组。

1.2.2 制模及方法 A组经尾静脉注射生理盐水0.13 ml/kg作为健康对照。B组与C组分别给予注射油酸0.13 ml/kg ,12 h后经尾动脉取血0.2 ml立即用手持式血气分析仪器行血气分析并打印结果，以氧合指数PaO₂/FiO₂≤300为造模成功，确定模型成功后C组经尾静脉注射血必净（4 ml/kg）,A组和B组注射NS（4 mL/kg）,每天给药1次，连续7 d，期间对大鼠活动、饮食及体质量密切观察。分别于给药后24 h、7 d、14 d、28 d随机处死5只大鼠，并按设计要求留取标本。

1.2.3 标本处理 麻醉后经心脏取血约4 mL,注入离心管经两次离心后取上清液约1.5 ml -80 ℃低温冰箱冷冻保存待测，取出心肺照相后，左肺称湿质量后,60 ℃恒温烘干72 h至恒重后称干质量并计算W/D，取右肺下叶-80 ℃冷冻保存待测，右肺上叶用10%甲醛固定常规包埋、切片，进行HE和Masson染色后镜检及读片。

1.2.4 指标检测 ELISA法检测血清中Ⅲ型前胶原，在酶标仪上根据标准曲线定量得出其浓度。

1.3 统计学方法

各组计量资料数据均以均数±标准差（x±s）表示，在符合正态分布和方差齐性同时，组间均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析（One-way ANOVA），均数间差别多重比较采用SNK-q检验；非正态分布或方差不齐采用秩和检验。所有数据均用SPSS 13.0 统计软件包进行统计处理。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氧合指数的比较

B、C组与A组比较，氧合指数有显著降低（P＜0.05），见表1。

2.4 肺组织病理改变

2.4.1 大体病理 A组的肺组织色泽淡红，表面光滑；B组肺组织明显充血、水肿、表面渗出增多，体积明显增加，多呈暗紫色并伴有多灶性出血；C组肺组织水肿，体积增大，色泽暗红陈旧性出血较模型组有所减轻。

2.4.2 显微镜下观察 正常肺组织HE和Masson染色（×200）：A组肺泡内无明显渗出，肺泡壁连续，仅在血管周见一些蓝色的胶原纤维。第14 天模型组可见肺泡腔消失由胶原纤维替代，成纤维细胞和淋巴细胞侵润，浅蓝色的原纤维片状分布；随时间延长胶原纤维进行性增加，28 d模型组可见弥漫性增生的纤维。C组肺纤维增值进程与B组类似，7 d、14 d和28 d时点可见在肺间质间较多蓝色的胶原沉积，但病理改变较B组减轻。见图1。

A：正常肺组织肺泡间隔纤细，未见增生的纤维；B：正常肺组仅在血管周见一些蓝色的胶原纤维；C：7 d治疗血必净组，部分肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增宽，见一小片纤维组织增生伴少量淋巴细胞浸润；D：7 d治疗血必净组，在肺泡周围可见一些蓝色的胶原纤维；E：14 d模型组，肺组织结构破坏可见一片新生的纤维母细胞灶，周围可见少量淋巴细胞浸润；F：14 d模型组，浅蓝色的原纤维片状分布；F：14 d治疗组，肺泡结构部分破坏，间隔见片状增生的纤维组织伴少量炎症细胞浸润；H：14 d治疗组，可见蓝色片状的胶原纤维分布在肺泡间隔中；I：28 d模型组，肺泡结构广泛破坏，可见纤维组织弥漫大片状增生，间质见少量淋巴细胞浸润；J：28 d模型组，可见弥漫增生的纤维灶片状阳性；K：28 d治疗组，肺泡结构部分破坏，见两灶纤维母细胞灶，伴少量淋巴細胞浸润，L：28 d治疗组，纤维母细胞灶表达式蓝色

3 讨论

目前国内外对ALI后肺纤维化的研究主要集中在早期的炎症反应，而对ALI后肺纤维化的研究较少。肺纤维化是包括在ALI/ARDS的后期阶段、特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）、自身免疫性胶原血管疾病、放射病等许多疾病的一种特征^［5-6］。在急性或慢性肺损伤后许多相关系统被激活，从而对肺泡毛细血管结构和功能进行修复^［7］。肺泡上皮细胞和内皮细胞的增值、分化和迁徙可能修复损伤肺。更严重的损伤或不恰当修复可能引起增值异常、成纤维细胞激活伴随胶原蛋白和其他基质蛋白增强表达^［8］。纤维化结果导致气体交换降低、肺顺应性降低，促成肺动脉高压的发展^［9］。尽管ALI/ARDS和IPF是截然不同的两种临床疾病，但成纤维细胞的激活和增值在两者疾病的病理生理扮演重要角色。据统计，在美国每年有40万人被诊断为ALI/ARDS或IPF，两者均为高致死性疾病^［10］，故对急性肺損伤后纤维化进行探讨具有临床意义。

近年来的研究提示在ALI的早期即可出现成纤维细胞增生和胶原分泌增强，炎症和纤维化进程紧密的重叠，但会出现各自的调节，因此提供对独立于对影响纤维化的早期治疗成为可能^［11］。保护性通气策略的应用是ALI治疗的里程碑式进展^［12］，但因肺泡炎症渗出和间质纤维增殖效应，特别是后期的纤维化仍是其不良预后的关键。有研究发现，尽管ARDS的致病因素不同，ALI/ARDS的基本组织病理过程常被描述为弥漫性肺泡损伤，进程经历渗出、增殖、纤维化，三者之间互有重叠^［13］。渗出阶段表现为：肺泡上皮和血管内皮细胞坏死，中性粒细胞扣押、血小板-纤维蛋白栓子形成、间质水肿，肺泡腔内充满渗出液及纤维母细胞和红细胞，透明膜形成；第2周左右为增殖阶段，表现为肺泡内渗出，Ⅱ型肺泡上皮、成纤维细胞和肌纤维母细胞增殖发病3～4周以后，发生纤维增殖、纤维化，是后期的肺组织重构表现。但有研究提示纤维增殖可在发病24 h内出现，组织学改变可在发病2周内表现出来^［14］。肺泡上皮破坏是ALI/ARDS的标志，如何防止内皮细胞破坏、遏制病情进展，防止或减轻肺纤维化成为影响期预后的关键问题，也是临床医生们的共同期待。大量的研究试图应用糖皮质激素控制炎症反应，预防和治疗ARDS，但结果一直存在争议。最近有研究认为尽管糖皮质激素可能对改善心肺生理有益但是对患者远期预后无改善，认为不支持对持续ARDS常规使用糖皮质激素^{［11］。对此目前还测试了包括多种抗氧化剂、骨髓抑制剂和细胞因子抑制剂，但至今仍未取得有效的治疗效果。为此笔者试图用中药制剂血必净对此进行探讨。}

血必净是由丹参、川芎、赤芍、红花、当归等多味活血化瘀的中药组成。已有研究显示，血必净中的丹参具有可改善微循环、较强的抗脂质过氧化和抗氧自由基功效；川芎具有抗氧化、清除氧自由基、增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性、抑制中性粒细胞粘附集聚、活化；赤芍所含的赤芍总苷对缺氧、一氧化氮和氧自由基损伤有保护区效应；当归中的当归多糖具有较强的清除活性氧自由基能力；红花也有清除自由基作用^［15-16］。血必净还具有拮抗内毒素诱导单核巨噬细胞产生内源性炎症介质失控性释放，抑制血小板聚集等作用。研究发现血必净对大鼠肝缺血-再灌注后ALI有保护作用，认为可能与其抑制中性粒细胞在肺内集聚、减少氧自由基有关。血必净对内毒素损伤的内皮细胞有保护作用，可降低血浆中的肝细胞生长因子（HGF）、纤维母细胞生长因子-7的异常升高，减轻肺脏的炎症反应，发挥肺组织的保护作用。本药还具有抑制转化生长因子β1的表达，可能通过抑制前胶原蛋白mRNA表达、降低脂质过氧化酶含量、提高超氧化物歧化酶活性、减少成纤维细胞生成，抑制细胞外基质的沉积;从而显著减少转化生长因子β1的表达，改善肺纤维化程序，抑制肺纤维化发展^［3］。还有研究用血必净联合前列腺素E1能有效改善实验性肺纤维化大鼠的病理改变，并延缓其恶化进程，认为可能是通过抑制TNF-α、TGF-β1的表达，减轻早期炎症反应并减少胶原蛋白的产生，使炎症及纤维化病变减轻，从而产生防治急性肺纤维化的作用^［16］。有研究通过血必净对心跳骤停复苏后大鼠干预发现血必净可明显调节心脑组织中的TGF-β1和p38MAPK含量。肺纤维化的增值包含胶原沉积和降解两者之间复杂的作用过程^［17］。在ARDS时Ⅲ胶原是最先沉积，它容易被破坏，而后变为更持久的Ⅰ型胶原^［18］。通过检测反映肺纤维化指标的PCⅢ可以从一定程度上了解到肺纤维化肺内胶原沉积其血中胶原含量的变化趋势。本研究通过检测血清和支气管肺泡灌洗液中PCⅢ浓度以及肺组织病理等方面来了解ALI后肺纤维化的程度；以及通过血必净干预来研究对ALI后肺纤维化的影响。

本实验发现血必净干预组血清和支气管肺泡灌洗液中PCⅢ较模型组明显减低,提示血必净对大鼠ALI后肺纤维化有一定抑制，该药有使平衡向好的方向转换，血必净对大鼠ALI治疗有效。为临床治疗ALI提供新选择但其临床功效和作用机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2012-01-17）

（本文编辑：何小军）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.08.010

基金项目：广州市医药卫生科技项目（2009-YB-237）

作者单位：510120 广州，广州医学院第一附属医院急诊科

通信作者：梁子敬，Email: liang-zj-doctor@163.com

中华急诊医学杂志2012年8月第21卷第8期Chin J Emerg Med,August 2012,Vol.21,No.8

P840-845