丙戊酸盐对胃癌细胞株SGC－7901／VCR耐药性的逆转作用＊

缪肖波，刘求真，姚开泰，肖广惠

（南方医科大学肿瘤研究所，广州510515）

胃癌是世界常见恶性肿瘤之一［1］，目前早期胃癌多采用手术治疗为主的综合治疗，而对于中晚期患者，化疗则是综合治疗的重要措施之一［2］。然而导致化疗失败的重要原因就是化疗过程中形成的多药耐药性（multidrug resistance，MDR）［3］。多药耐药性是指恶性肿瘤细胞接触一种抗癌药后，继而对多种结构不同、作用机制各异的其他抗癌药产生耐药性的现象［4］，其成为化疗失败以及缓解后复发的主要原因。因此，寻找能够逆转MDR的药物成为胃癌研究的热点。丙戊酸盐（Valproate）是一种短链脂肪酸，目前在临床上被作为一线药物用来治疗癫痫［5－6］，后有实验证明丙戊酸盐具有抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的作用［7］，这类抑制剂被称为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，是一种新型且有效的抗肿瘤药物，可促进组蛋白乙酰化，激活某些基因转录，诱导细胞生长停滞、促进细胞分化和凋亡，并具有抑制肿瘤血管生成和转移的作用［8］。丙戊酸盐作为抗肿瘤药物的临床实验正在进行。本实验选择SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞作为实验对象，观察丙戊酸盐对耐药细胞SGC－7901／VCR耐药性的逆转作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胃癌细胞株SGC－7901及其耐药株SGC－7901／VCR由中南大学湘雅医学院细胞中心提供，将细胞置入含青／链霉素100U／mL青／链霉素和10%胎牛血清的RPMI－1640培养液中，在37℃，5%CO2恒温培养箱密闭条件下培养，每3天换1次液。

1.2 主要试剂和药物 胎牛血清、RRPMI－1640培养液、青／链霉素（Gibco）；MTT（Sigma）；二甲亚砜（DMSO，Sigma）；长春新碱（VCR，深圳万乐药业）；丙戊酸盐（Chalbiochem）；Annexin V－FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物）；抗乙酰化组蛋白3（acetylated histone H3，AcH3）单克隆抗体、β－Actin抗体（Santa Cruz）。

1.3 MTT法检测SGC－7901及SGC－7901／VCR细胞对 VCR及丙戊酸盐的敏感性 以每孔5 000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μL，每组3孔，同时设空白对照（仅加培养基），分别加入 VCR（浓度梯度为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.320、0.160和0.000μmol／L）或丙戊酸盐（浓度梯度为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.0mmol／L）培养48 h后，每孔加入5mg／mL的MTT 20μL，37℃继续培养4h后终止培养，小心吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，室温孵育10min，微振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，测定OD值，绘制耐药曲线。IC50软件分析SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞对VCR及丙戊酸盐的IC50，并计算耐药指数，对某一药物的RI＝耐药细胞IC50／亲本细胞IC50。

1.4 丙戊酸盐对耐药细胞SGC－7901／VCR耐VCR的逆转作用 制备单细胞悬液，接种于96空培养板，每孔5 000个细胞，37℃、5%CO2培养箱过夜，待细胞完全贴壁后，加入药物。MTT法检测丙戊酸盐对耐药细胞SGC－7901／VCR耐VCR的逆转时，VCR设8个药物梯度，分别为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.320、0.160和0.000μmol／L；丙戊酸盐设3个药物梯度，分别为1.0、0.5和0.0mmol／L。共设3个实验组：（1）VCR；（2）0.5mmol／L ＋ VCR；（3）1.0mmol／L ＋ VCR。加入药物继续培养48h后，每孔加入5mg／mL的 MTT 20 μL，37℃继续培养4h后终止培养，小心吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，室温孵育10min，微振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，测定OD值，绘制耐药曲线。观察耐药细胞SGC－7901／VCR对VCR的敏感性，计算IC50和逆转指数 （逆转指数＝使用逆转药物前IC50／使用逆转药物后IC50）。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集对数生长期的SGC－7901／VCR细胞，消化、计数、铺板，37℃、5%CO2培养箱中培养，待培养12h细胞完全贴壁后，进行不同处理（未处理组、1.0μmol／L VCR处理组、0.5mmol／L丙戊酸盐处理组、1.0 mmol／L 丙戊酸盐处理组、1.0μmol／L VCR ＋ 0.5mmol／L丙戊酸盐处理组和1μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸盐处理组），药物作用48h后，收集所有细胞（包括液体中悬浮的细胞）后计数，调整细胞浓度为1×106／mL。SGC－7901／VCR细胞未处理组分别设空白对照管和凋亡检测管，其余药物处理组只设凋亡检测管。凋亡检测管反应容积为100μL，加入FITC－Annexin V和PI各5μL后室温避光孵育30min。孵育完成后，D－Hanks洗涤2次后D－hanks重悬，上BD公司FACSAria型号流式细胞仪检测细胞凋亡，并计算总凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）。

1.6 Westernblot实验检测SGC－7901／VCR细胞中乙酰化组蛋白AcH3的表达 首先提取亲代细胞SGC－7901和耐药细胞SGC－7901／VCR的总蛋白，检测两细胞中AcH3的表达差异。继而用不同浓度（0.0、0.5、1.0或2.0mmol／L）的丙戊酸盐作用于SGC－7901／VCR细胞48h或同一浓度（1mmol／L）作用12、24、48h后，检测丙戊酸盐其影响AcH3表达的规律。为了明确丙戊酸盐对AcH3的特异性，4种处理方法（未处理、1.0μmol／L VCR、1.0mmol／L 丙戊酸盐和1.0μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸盐）处理SGC－7901／VCR细胞48h后，检测细胞中AcH3的表达。提取的蛋白经BCA法测定蛋白浓度后，煮沸变性上样于SDS－PAGE凝胶进行电泳分离，转膜，封闭，然后依次结合AcH3单克隆抗体和HRP标记的二抗，将ECL发光液Solution A和Solution B按1∶1比例混合，Bio－Rad公司molecular Imager ChemiDocTM XRS＋成像系统下采集曝光图像。

1.7 统计学处理 数据采用SPSS13.0进行分析，计量资料以±s表示，两样本比较采用独立样本t检验分析；One－way ANOVA比较同一细胞不同处理组的差异；两细胞不同药物处理的凋亡率数据采用析因设计方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SGC－7901及SGC－7901／VCR细胞对 VCR及丙戊酸盐的敏感性 与亲代细胞SGC－7901相比，耐药细胞SGC－7901对 VCR 不敏感，IC50分 别为 （0.073±0.020）μmol／L 和（2.530±0.287）μmol／L，两者差异具有统计学意义（t＝ －14.793，P＝0.004），耐药倍数为36.0。而SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞对丙戊酸盐的IC50分别为3.681±0.889 mmol／L和3.313±0.511mmol／L，两者之间差异无统计学意义（t＝0.621，P＝0.568），这表明 SGC－7901和 SGC－7901／VCR对丙戊酸盐的敏感性基本相同。根据丙戊酸盐抑制细胞增殖曲线可知，丙戊酸盐在0.5mmol／L和1mmol／L时，对SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞的抑制作用较弱，细胞存活率大于60%，细胞毒性较弱，本研究选择这两个浓度作为逆转耐药时的药物处理浓度，见表1。

表1 MTT比较SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞的耐药能力（±s，n＝3）

表1 MTT比较SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞的耐药能力（±s，n＝3）

IC50细胞系VCR（μmoL） 丙戊酸盐（mmol／L）SGC－7901 0.073±0.020 3.681±0.889 SGC－7901／VCR 2.530±0.287 3.313±0.511 t－14.793 0.621 P 0.004 0.568耐药指数36.0 1.0

2.2 丙戊酸盐对SGC－7901／VCR细胞耐VCR的逆转作用与SGC－7901细胞相比，SGC－7901／VCR细胞对 VCR 的耐药指数约为36.0。为了检测丙戊酸盐对耐药细胞耐VCR逆转作用的效果，将丙戊酸盐与VCR联用，在0.5mmol／L或1.0 mmol／L丙戊酸盐存在的条件下，SGC－7901／VCR细胞对VCR的敏感性明显增加，IC50由（2.433±0.208）μmol／L分别降为（0.850±0.132）μmol／L和（0.433±0.104）μmol／L，且随着丙戊酸盐浓度的上升逆转作用增强，各处理组间差异有统计学意义（F＝139.826，P＝0.000），逆转指数分别为2.86和5.62，见表2。

2.3 丙戊酸盐与VCR联用可增加SGC－7901／VCR细胞的凋亡率 为了检测丙戊酸盐单用或联合VCR使用后对细胞凋亡的影响，将耐药细胞SGC－7901／VCR依次进行6种处理，分别为未处理、1.0μmol／L VCR处理、0.5mmol／L丙戊酸盐处理、1.0mmol／L 丙 戊 酸 盐 处 理、1.0μmol／LVCR＋0.5 mmol／L丙戊酸盐处理和1.0μmol／L VCR＋0.5mmol／L丙戊酸盐处理。48h后流式细胞术检测细胞凋亡结果显示凋亡率分别为（3.600±0.552）%、（11.600±2.193）%、（12.133±2.103）%、（17.967±2.616）%、（32.7±2.685）%和（41.900±3.659）%。除1.0μmol／L VCR处理组与0.5mmol／L丙戊酸盐处理组之间差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。此结果表明丙戊酸盐与VCR联用可促进细胞的凋亡，且这种作用具有浓度依赖性，见图2。

表2 丙戊酸盐对SGC－7901／VCR细胞耐药性的逆转作用（n＝3）

图2 丙戊酸盐与VCR联用对SGC－7901／VCR细胞凋亡的影响（n＝3）

图3 丙戊酸盐诱导SGC－7901／VCR细胞中组蛋白的增加

2.4 丙戊酸盐逆转SGC－7901／VCR细胞耐药的机制 Western blot实验结果显示，与亲代细胞SGC－7901相比，耐药细胞SGC－7901／VCR的 AcH3的表达降低（图3A）。未处理、1 μmol／LVCR、1.0mmol／L丙戊酸盐和1μmol／L VCR ＋1.0 mmol／L丙戊酸盐等4种处理后 SGC－7901／VCR 细胞中AcH3检测结果显示：与未处理组相比，1.0mmol／L丙戊酸盐和1.0μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸盐处理组AcH3表达明显增高，而1.0μmol／L VCR处理组无变化（图3B）。这说明丙戊酸盐能够增加SGC－7901／VCR细胞中AcH3的表达。用0.5、1.0或2.0mmol／L丙戊酸盐分别处理SGC－7901／VCR细胞48h后，AcH3的表达量随药物浓度的上升而逐渐增加（图3C）；用同一浓度（1.0mmol／L）的丙戊酸盐处理SGC－7901／VCR细胞12、24、48h后发现，随处理时间的延长，AcH3的表达量也逐渐增加（图3D）。这说明丙戊酸盐增加AcH3的表达具有浓度和时间依赖性。

3 讨 论

在近代肿瘤治疗进程中，MDR已成为影响化疗效果和远期预后的重要因素［9］。自1970年Bieder等［10］首次阐述 MDR以来，对MDR形成机制的研究持续存在。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是治疗失败的主要原因，也是临床所需要解决的难题［11］。由于肿瘤细胞发生MDR的机制十分复杂，因此选择理想的耐药细胞模型是解决问题最基本的条件。本研究选择的耐药细胞SGC－7901／VCR与亲代细胞 SGC－7901相比对VCR化疗药物均有较强耐药性，耐药倍数高达36.0，是研究逆转耐药的较好模型。Kim等［12］的实验发现多数胃癌组织中有HDAC1mRNA和蛋白高表达，这表明在胃癌组织中组蛋白去乙酰化酶的表达增加，而组蛋白的表达是明显降低的。亲代细胞SGC－7901与耐药细胞SGC－7901／VCR细胞作为胃癌细胞系，也具有此特点，因此可以选择胃癌细胞作为丙戊酸盐逆转耐药的研究对象。

组蛋白氨基端富含赖氨酸残基，对其中保守位点的乙酰化修饰可以影响DNA与转录调节复合物的结合，调控DNA的复制和修复、基因表达、染色质组装和细胞有丝分裂［13］。组蛋白的乙酰化状态由两类酶来决定，即组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase，HDAC）［14］。这两类酶对组蛋白乙酰化作用调控的失衡，可导致染色质结构改变，使调节细胞周期、细胞分化、凋亡的基因转录失衡，从而导致细胞的恶变。HDACIs作为一类新型、有效的抗肿瘤化合物，可促进组蛋白乙酰化，激活某些基因转录，诱导细胞生长停滞、促进细胞分化和凋亡［15］。丙戊酸盐作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACIs），与SAHA、TSA 等 HDACIs相比，具有作用时间长，毒性作用较弱等优点［16］。而且本研究发现丙戊酸盐 对 SGC－7901 和 SGC－7901／VCR 细 胞 的 IC50分 别 为（3.681±0.889）mmol／L和（3.313±0.511）mmol／L，二者之间差异无统计学意义，这表明与SGC－7901相比，SGC－7901／VCR对丙戊酸盐的敏感性相同。本研究选取0.5mmol／L和1.0 mmol／L两个较低浓度丙戊酸盐与VCR联用，观察其逆转耐药效果，结果发现丙戊酸盐使SGC－7901／VCR细胞对VCR的敏感性明显增加，IC50由（2.433±0.208）mol／L分别降为（0.850±0.132）μmol／L和（0.433±0.104）μmol／L，逆转指数分别为2.86和5.62。

Keshelava等［17］在神经母细胞瘤的研究中发现，耐药细胞中组蛋白去乙酰化酶的表达明显增加，即乙酰化组蛋白表达明显降低。通过抑制HDAC的表达或降低其活性可增加多药耐药细胞对普通化疗药物的敏感性。为了探讨丙戊酸盐逆转耐药的机制，本实验首先检测了亲代细胞和耐药细胞中AcH3的表达，结果证实耐药细胞SGC－7901／VCR中AcH3的表达量明显低于亲代细胞SGC－7901。丙戊酸盐单独或与VCR联用后检测结果显示VCR不能增加AcH3的表达，而丙戊酸盐增加AcH3表达则具有浓度和时间依赖性。增加的乙酰化组蛋白通过多种途径杀灭肿瘤细胞，其中最重要的就是增加细胞凋亡［18］。因此，本实验将低浓度丙戊酸盐和VCR联用后流式检测细胞凋亡的变化，结果发现：与未处理组相比，单独丙戊酸盐或VCR处理细胞均可诱导凋亡但比例较低，而两药联用时耐药细胞SGC－7901／VCR细胞的凋亡率明显增加。因此，丙戊酸盐通过抑制去乙酰化酶增加乙酰化组蛋白（如AcH3）的表达，进而通过一系列机制促进细胞凋亡逆转耐药。

目前，许多组蛋白去乙酰化酶抑制剂类药物进入了临床实验和一线治疗，如 MS－275、他地那兰、belinostat、vorinostat、帕比司他等，均显示了较好的抗肿瘤效果［19］。作为一种新型非细胞毒的广谱抗肿瘤药物，HDACi具有良好的临床应用前景和价值，作为其中的一种，由于丙戊酸盐作用时间长、安全范围大等特点，特别是联合其他化疗药物时对化疗疗效的促进作用，将会使其应用得到越来越多的重视。

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