银杏叶提取物对糖尿病外周血内皮祖细胞超氧化物歧化酶及凋亡的影响

王晓霞，王颖超，赵 明

0 引 言

EPCs是一种在特定条件下可以分化成血管内皮细胞的前体细胞，能形成新生血管，是血管修复中的关键细胞［1］。在糖尿病状态下，活性氧的过度产生及氧化应激水平提高致EPCs功能受损［2］。NO是EPCs动员、分化及功能的主要调控者，活性氧能够产生过多的超氧负离子O2－及过氧亚硝酸盐，影响NO的生物利用度，降低了NO对EPCs的有利影响［3］。EPCs在缺血组织的新生血管方面及损伤血管的再内皮化起重要的作用，因此EPCs完整性及功能活动对于糖尿病血管病变起着至关重要的作用。高塘状态下，活性氧过度产生，导致EPCs凋亡率增加，损伤内皮细胞的完整性。可见，糖尿病EPCs凋亡率的增加是导致内皮功能障碍和糖尿病动脉粥样硬化发展的重要环节［4］。SOD能够中和超氧负离子O2－，EPCs通过提高SOD活性来增强抵御氧化应激的能力［2］。GBE主要成分是黄酮类及内酯类，具有抗氧化，清除氧自由基，抗衰老等作用。本研究通过GBE干预体外培养的EPCs，观察其对EPCs凋亡、SOD活性的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 健康成人外周血15份(20 ml/份)为对照组，糖尿病外周血25份(20 ml/份)为实验组。入选标准:年龄＞30岁、不吸烟的体检正常者及糖尿病患者。排除标准:①吸烟;②近期外伤及手术;③长期使用维生素C、维生素E等抗氧化剂、降血脂类药物、非甾体类抗炎药、激素或免疫抑制剂影响氧化应激状态的药物;④合并有冠状动脉硬化性心脏病、脑血管疾病、糖尿病大血管并发症及糖尿病肾病、视网膜等微血管并发症等影响EPCs的因素。

1.2 试剂 人淋巴细胞分离液Ficoll-paque购自天津灏洋公司，M199培养基、胎牛血清为Hyclone公司产品，纤维连接蛋白为R＆D公司产品，血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factors-1，IGF-1)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)为 Peprotech产品，FITCUEA-I、Dil-Ac-LDL为 Sigma公司产品，4%多聚甲醛、胰蛋白酶购自北京泰泽瑞达科技有限公司，实验耗材购自南京鼎国生物技术公司，GBE购自南京泽朗医药科技有限公司，SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EPCs分离 取成人外周血 20 ml，0.2 ml肝素钠抗凝，PBS对倍稀释，按1∶2加入人淋巴细胞分离液和稀释的外周血［5］，2500r/min 离心30min，离心半径12cm，小心吸取中间白膜层单个核细胞，加入2ml等渗盐水适当稀释，2500r/min离心5min。

1.3.2 诱导分化 纤维连接蛋白按说明溶解稀释，配制为 1 μg/ml，包被 24 孔板，每孔 200 μl，37℃ 孵育过夜，临用前吸出多余液体。将分离的单个核细胞按(1～2)×106/ml接种于包被好的24孔板中，每份标本接种12孔，每孔加入含20%胎牛血清，VEGF10 ng/ml，bFGF 2 ng/ml，IGF 2 ng/ml，EGF 10 ng/ml［5］，青霉素及链霉素各 0.5 μl的 M199 培养基0.5 ml。放入含5%CO2的37℃孵育箱中培养，间隔1d，用PBS洗去未贴壁细胞，换液，以后每4d换液1次。EPCs形态学变化见图1。

1.3.3 EPCs鉴定 用添加血清和上述各种细胞因子的M199培养基在6孔板中按上述方法培养外周血中分离的单个核细胞爬片7 d，取出细胞爬片，用单纯的 M199培养液洗2次，加入 Dil-Ac-LDL(10 μg/ml)37℃ 避光孵育贴壁细胞 4 h，单纯的M199培养液洗3次后，用2%多聚甲醛固定细胞10 min，固定后用 PBS洗3次。FITC-UEA-I(10 μg/ml)加入上述标本于37℃避光孵育贴壁细胞1h，PBS洗3次，倒置荧光显微镜下观察，吞噬Dil-Ac-LDL呈现红光，FITC-UEA-I呈现绿光，染色双阳性细胞呈黄色鉴定为 EPCs［6］。见图 2。

1.3.4 SOD活性检测 细胞培养第7天换液，添加含浓度分别为0 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L GBE培养基［7］，每组浓度设置3个复孔，药物干预24h后，提取细胞上清液，根据试剂盒上的说明进行检测。

1.3.5 EPCs凋亡检测 细胞培养第7天换液，添加含浓度分别为 0 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L GBE培养基，每组浓度设置3个复孔，药物干预24h后，收集细胞上清液，每孔加入40 μl胰酶消化3～5 min，加入160μl血清吹打，收集EPCs用PBS洗2次后重悬于结合液中，依次加入5μlAnnexinV-FITC4℃孵育15min和10μl PI 4℃孵育5min，流式检测。

2 结 果

2.1 分光光度计检测不同浓度GBE干预EPCs 24 h后的SOD活性 实验组中，10 mg/L能够提高EPCs SOD活性但无明显差异(P＞0.05)，25 mg/L GBE及50 mg/LGBE明显提高EPCs SOD活性(P＜0.05)，且随GBE浓度增高效果愈明显，对照组中，各浓度GBE提高EPCs SOD活性，但改变不具有统计学意义(P＞0.05)，结果见表1。

表1 分光光度计检测不同浓度GBE干预EPCs 24 h后的SOD活性Table 1 SOD activity of EPCs after 24 h GBE intervention at 0，10，25 and 50 mg/L by spectrophotometry

2.2 流式细胞仪检测不同浓度GBE干预EPCs 24 h后的凋亡率 实验组中，EPCs凋亡率随GBE浓度增高而降低(P＜0.05)，50 mg/L GBE降低EPCs凋亡率最显著(P＜0.01);对照组中，各浓度 GBE降低EPCs凋亡率，但改变不具有统计学意义(P＞0.05)，结果见表2，图3。

表2 流式细胞仪检测不同浓度GBE干预EPCs 24 h后的凋亡率(%)Table 2 Apoptosis of EPCs after 24 h GBE intervention at 0，10，25 and 50 mg/L by fluorescence-activated cell sorting(%)

图1 EPCs的形态学观察Figure 1 Morphological changes of EPCs at different times of culture

图2 EPCs的鉴定图片Figure 2 Identifcation of EPCs

图3 AnnexinV-FITC/PI染色和流式细胞仪分析EPCs凋亡图Figure 3 Apoptosis of EPCs by AnnexinV-FITC/PI dyeing and fluorescence-activated cell sorting

3 讨 论

EPCs是具有迁移、增殖、黏附和分化成内皮细胞功能的前体细胞，不仅参与胚胎期血管的形成，也参与成人新生血管的发生［8］。EPCs数目及功能与内皮功能及血管再生正相关，而与心血管危险因素负相关。EPCs数目减少是动脉粥样硬化发病率和死亡率的预警信号［9］。糖尿病动脉粥样硬化疾病发展过程中，除了年龄这一影响因素，缺少EPCs依赖的动脉修补是主要原因之一。基于遗传学的分子证据显示动脉粥样硬化损伤最开始的形式是动脉修补不足而非动脉损伤［10］。因此，糖尿病时动脉损伤超过EPCs的修补能力而达到一种新的动态平衡，尤其当EPCs的凋亡率不断增加的情况下，EPCs动脉修补功能几近耗竭。另外，EPCs凋亡导致血管内皮通透性增加，血细胞黏附到血管壁，粥样斑块剥脱及随后的血栓形成［11］，直接导致糖尿病相关并发症的发展。

氧化应激反应是糖尿病及其并发症最重要的发病机制之一，骨髓来源的EPCs在血管生成及归巢到外周血中对伤口愈合起关键作用，内皮细胞氮氧化物合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表达及磷酸化作用对于EPCs的存活、迁移、血管发生至关重要。正常情况下，eNOS以精氨酸为底物，在四氢生物蝶呤(BH4)辅助下合成NO，但氧化应激状态下，BH4被氧化，eNOS解偶联失活，使EPCs从骨髓动员至外周血减少［12－13］。燕建军等［7］发现氧化应激是重要的细胞凋亡诱导因子，高糖状态下细胞代谢加剧，甚至代谢紊乱，使细胞内反应性氧自由基(ROS)水平升高，谷胱甘肽氧化还原循环障碍，细胞清除氧自由基能力下降，诱导细胞凋亡。GBE降低高糖条件下视网膜血管内皮细胞的凋亡与清除氧自由基，抗氧化以及影响糖代谢的作用密切相关。与上述结果一致，本研究发现不同浓度GBE干预体外培养的EPCs，因GBE抗氧化特性，使EPCs SOD活性提高，凋亡率下降，且呈剂量依赖性。可见，活性氧在糖尿病中扮演了重要角色，EPCs凋亡率的增加、SOD活性的改变与糖尿病时炎性因子、氧化应激水平的不断提高有关［14］。另有研究表明，胰岛素治疗糖尿病时，能够增加EPCs的NO产量，但不改变产量及形成集落的能力，然而，联合使用SOD及胰岛素治疗，则明显改善上述情况。Hamed等［15］研究数据显示，SOD在EPCs中显示一个必不可少的作用，同时也强调了在糖尿病中应用抗氧化治疗的重要性。

来源于骨髓的EPCs在内皮细胞的管理和保护上面起到了一个完整的作用，同样在血管形成方面，外周循环EPCs数目及功能对于大多数疾病而言，是血管损伤的有力标记，这一标记独立于传统或非传统的致病因素［如:高血压、高胆固醇血症及C-反应蛋白(c-reactive protein，CRP)］。有研究表明，在小鼠体内注入外源性EPCs，通过减少致病因素、恢复缺血组织的修复提高内皮功能，显示潜在的血管修复能力［16］。基于这一细胞治疗，自体同源的EPCs作为一个新的治疗方案用于糖尿病患者的血管重建及血管修复，然而，用于细胞移植的EPCs保留了体内功能障碍特性，影响了这种方案的可行性。同时，糖尿病患者体内的血管致病因素是可变的，临床条件下，单纯的通过EPCs数目及功能变化并不能充分反映血管疾病的进展，因为这些变化同样存在外膜细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞这类血管相关控制因素［17］。因此，EPCs治疗糖尿病时，可能需要联合战略，通过调整周围细胞的功能来影响EPCs，以达到最佳优化治疗方案，至于各种细胞如何相互影响、相互制约的关系是复杂的，受多种因素影响，这个问题至今尚未完全阐述清楚，需进一步研究。

［1］Fadini GP，Avogaro A.Potential manipulation of endothelial progenitor cells in diabetes and its complications［J］.Diabetes Obes Metab，2010，12(7):570-583.

［2］Galasso G，Schiekofer S，Sato K，et al.Impaired angiogenesis in glutathione peroxidase-1-deficient mice is associated endothelial progenitor cell dysfunction［J］.Circ Res，2006，98(2):254-261.

［3］Thum T，Thum S，Daiber A，et al.Differential Effects of Organic Nitrates on Endothelial Progenitor Cells Are Determined by Oxidative Stress［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(4)，748-754.

［4］Zhang LJ，Liu WX，Chen YD.Proliferation，migration and apoptosis activities of endothelial progenitor cells in acute coronary syndrome［J］.Chin Med J(Engl)，2010，123(19):2656-2661.

［5］刘泽灏，雷闽湘，王爱民，等.成人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化［J］.中南大学学报，2005，30(5):566-569.

［6］Churdchomjan W，Kheolamai P，Manochantr S，et al.Comparison of endothelial progenitor cell function in type 2 diabetes with good and poor glycemic control［J］.BMC Endocr Disord，2010，10:5.

［7］燕建军，彭辉灿，王俞方，等.银杏叶提取物对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖、凋亡的影响［J］.国际眼科杂志，2008，8(12):2417-2420.

［8］周 鑫，夏欣一，黄宇烽.循环内皮细胞的检测及其在肿瘤临床中的应用进展［J］.医学研究生学报，2010，23(5):543-546.

［9］Foresta C，De Toni L，Ferlin A，et al.Clinical implication of endothelial progenitor cells［J］.Expert Rev Mol Diaqn，2010，10(1):89-105.

［10］Seo DM，Wang L，Liu ZJ，et al.Inflammation，stem cells and atherosclerosis genetics［J］.Curr Opin Mol Ther，2010，12(6):712-723.

［11］Dernbach E，Urbich C，Brandes RP，et al.Antioxidative stressassociated genes in circulating progenitor cells:evidence for enhanced resistance against oxidative stress［J］.Blood，2004，104(12):3591-3597.

［12］吴雪晖，罗 飞，何清义.血管内皮祖细胞研究进展［J］.医学研究生学报，2008，21(9):981-985.

［13］赵 明.糖尿病下肢血管病变与血管重建［J］.医学研究生学报，2010，23(12):1233-1235.

［14］George J，Goldstein E，Abashidze S，et al.Circulating endothelial progenitor cells in patients with unstable angina:association with systemic inflammation［J］.Eur Heart J，2004，25(12):1003-1008.

［15］Hamed S，Brenner B，Aharon A.Nitric oxide and superoxide dismutase modulate endothelial progenitor cell function in type 2 diabetes mellitus［J］.Cardiovasc Diabetol，2009，8:56.

［16］Jarajapu YP，Grant MB.The promise of cell-based therapies for diabetic complications:challenges and solutions［J］.Circ Res，2010，106(5):854-869.

［17］Sen S，McDonald SP，Coates PT，et al.Endothelial progenitor cells:novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease［J］.Clin Sci(Lond)，2011，120(7):263-283.