补充磷脂对大鼠腓肠肌钝挫伤后腓肠肌氧自由基反应和脂质过氧化反应的影响

周 静,董义俊,葛新发,李可峰,陈京来,董贵俊

(1.中国石油大学体育教学部,山东 青岛 266555;2.47师预备役坦克团,吉林 四平 136500;3.山东体育学院,山东 济南250102)

钝挫伤是一种常见的运动损伤,在不同运动项目中占有很高的比例.在对抗性项目或者意外事故中,钝挫伤具有更高的发生几率,这通常会严重影响伤者的运动能力及运动寿命.钝挫伤后,由于肌肉自身恢复速度较慢,且容易生成疤痕组织,因此如何预防疤痕组织生成,加快骨骼肌损伤修复的速度,一直是运动医学领域研究热点之一[1].钝挫伤早期,细胞膜通透性增加,炎性细胞浸润导致大量氧自由基生成,容易加重损伤的程度,如何防范钝挫伤后自由基的产生是促进肌纤维再生的关键[2-4].磷脂作为细胞膜系统的基本成分,对生物膜的流动性、通透性和完整性起着重要的作用.补充磷脂可以增加细胞膜的流动性、韧性和变形能力,增强细胞膜的功能.因而,磷脂补充可能益于修复细胞膜损伤,加速钝挫伤后损伤修复程度[5-6].

本研究通过对重物自由落体诱发的腓肠肌钝挫伤后恢复过程的大鼠补充外源性磷脂,观察钝挫伤后12 h、24 h、2 d、10 d、17 d、30 d 后大鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量变化,探讨补充磷脂后对大鼠钝挫伤腓肠肌中氧自由基反应和脂质过氧化反应的影响.

1 材料与方法

1.1 动物分组及喂养方法

实验动物采用雄性wistar大鼠132只,购自山大动物中心提供,体重140-160 g,分笼饲养,自由进食、饮水,适应性喂养3天,饲养条件为室温(24±2)℃,相对湿度控制在(55±15)%.大豆磷脂饲料,由基础饲料+10%大豆粉末磷脂(购自北京美亚斯磷脂技术有限公司)配制而成.随机分四组,除安静对照组6只外,其余每组42只.具体分组情况和喂养情况为:安静对照组(CK)服用基础饲料;补充磷脂对照组(PC)和钝挫伤后自然愈合组(NH)服用添加大豆粉末磷脂的饲料;钝挫伤后补充磷脂愈合组(PB).

1.2 重物击打构建腓肠肌钝挫伤模型

结合前期我们对于骨骼肌钝挫伤的研究[7],将实验大鼠经10 g/L硫喷妥钠麻醉后,固体木制圆柱体下落导致右小腿内侧面(其皮下为腓肠肌中段)一次打击伤[7],打击面的直径为110 cm.下落物体的长度为20 cm,质量为620 g,从垂直40 cm高处落下,计算后重力为6108 N,动能为2143 J.骨骼肌钝挫后,解剖证实钝挫伤发生情况[8].

1.3 测定大鼠腓肠肌 SOD、CAT、GSH-Px及 MDA变化情况

钝挫伤后12 h、24 h、2 d、10 d、17 d、30 d 后采用戊巴比妥钠麻醉将腓肠肌整块取出,在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆组织,用漩涡混合仪震荡30秒后冰浴放置5分钟,使用200 ul的移液器将组织匀浆液转移至EP管中;放入高速冷冻离心机14000 r/min、4℃离心30分钟,将上清液转移至新的EP管中,标记好后放入-70℃冰箱内备用.

SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法,MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法,CAT活性测定采用可见光法,GSH-Px活性测定采用谷胱甘肽氧化法,组织蛋白质浓度检测采用考马斯亮兰法,标准蛋白为BSA.上述试剂盒购自南京建成,具体操作参照试剂盒说明书进行.吸光度利用美国BECKMAN公司生产的BU800紫外分光光度计测定.

1.4 统计学分析

数据统计采用SPSS12.0统计软件进行分析,实验数据均以平均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,P<0.05表示具有显著性差异,P<0.01表示具有极显著性差异.

2 实验结果

2.1 不同组别大鼠腓肠肌SOD活性变化情况

大鼠腓肠肌钝挫伤后,NH组SOD活性表现为先上升再回落的趋势(图1).钝挫伤后12 h内,PB组SOD活性较CK和PC组显著性上升(P<0.05),24 h后检测发现显著性消失,至2-10 d后,检测发现PB组SOD活性与对照组出现极显著性差异(P<0.01).而自然愈合组在损伤后12 h内,SOD活性与CK和PC组相比出现显著性上升(P<0.05);随着CK和PC组SOD活性的上升,至钝挫伤后24 h,NH组与CK和PC组SOD活性之间未检出显著性差异;与此同时,钝挫伤后2-10 d里,PB组大鼠腓肠肌SOD活性显著高于NH组(P<0.01).钝挫伤后第10 d,PB组大鼠腓肠肌SOD活性达到最高值并仍显著性高于NH组、CK组及PC组.从第10d后,PB组SOD活性呈下降趋势,但仍高于其他三组.由此可见,补充磷脂在钝挫伤12 h内能提高大鼠腓肠肌SOD活性,同时能预防钝挫伤后2-10天自然愈合组出现的SOD活性急剧下降的过程,从而能长时间提高钝挫伤后腓肠肌SOD活性,有利于腓肠肌钝挫伤后修复过程.

2.2 不同组别大鼠腓肠肌MDA含量变化情况

大鼠受到钝挫伤后,PB及NH组中MDA含量在损伤后的2 d内,都表现出相对于对照组显著性上升的趋势,但是上升的比例有所不同.在钝挫伤后12 h内,虽然顿挫组MDA含量出现上升,但未出现统计学意义(P>0.05);24 h后,PB及NH组MDA含量较CK和PC组出现显著性升高(P<0.05),但两组之间未出现显著性差异(P>0.05);至损伤2 d后,PB组MDA含量显著性高于对照组(P<0.01),同时显著性高于PB组(P<0.05)说明自然愈合组内出现大量脂质过氧化反应,这种反应在PB组内得到有效遏制;损伤至10 d后,NH组MDA含量显著性高于其他组(P<0.05),其他组内部未发现显著性差异,说明补充磷脂能有效遏制钝挫伤初期(2-10 d)所发生的脂质过氧化反应,有利于腓肠肌钝挫伤后恢复.

图1 不同组别大鼠钝挫伤后腓肠肌SOD活性变化(n=6)

图2 不同组别大鼠腓肠肌MDA含量变化(n=6)

2.3 不同组别大鼠腓肠肌CAT活性变化情况

大鼠钝挫伤后CAT活性变化主要发生在钝挫伤后24 h内.钝挫伤后12 h内,腓肠肌中CAT活性明显升高(P<0.01),这种趋势在PB组和NH组表现一致,未发现显著性差异;至损伤24 h,PB及NH组CAT活性继续上升,与对照组比较表现出具有显著性差异,但是二者之间仍未出现显著性差异(P>0.05)说明,损伤早期(24 h之内),CAT活性会显著性提高,说明钝挫伤会导致活性氧代谢增强而使H2O2积累增加,从而导致细胞膜受到损害,加速细胞凋亡过程;补充磷脂组的CDK活性与自然愈合组并未表现出显著性差异,说明CDK活性的升高,可能是机体自适应过程,补充磷脂对缓解活性氧的产生,消除H2O2积累作用不明显.

图3 不同组别大鼠腓肠肌CAT活性变化(n=6)

2.4 不同组别大鼠腓肠肌GSH-Px活性变化情况

大鼠腓肠肌钝挫伤后24 h内,PB及NH组GSH-Px活性较对照组出现上升趋势,但统计学上未达到显著性水平(P>0.05),同时PB组及NH组之间未出现显著性差异(P>0.05);至损伤2 d后,NH组GSH-Px含量显著性高于CK和PC组(P<0.05),PB组GSH-Px活性也显著性提高(P<0.01);至损伤后10d,NH组和PB组GSH-Px活性极显著性高于对照组(P<0.01),同时PB组显著性高于 NH组(P<0.05).损伤10 d后,PB组与NH组GSH-Px含量逐渐下降,至损伤后30 d,恢复至对照组GSHPx活性水平.说明,损伤后补充磷脂从2 d起能显著性加快自由基清除,至10 d能最大程度提高GSH-Px活性,至24d后逐渐恢复至对照组GSH-Px水平.

图4 不同组别大鼠腓肠肌GSH-Px活性变化(n=6)

3 讨论

大鼠骨骼肌急性钝挫伤后,氧化应激反应主要发生在损伤部位,对于机体整体氧化及抗氧化水平影响未出现显著性变化[8],因此本研究主要采用对大鼠钝挫伤后取腓肠肌作为主要研究部位.大鼠腓肠肌钝挫伤后,超氧离子由于"呼吸爆发"过程而大量产生,从而对大鼠腓肠肌肌细胞膜等产生进一步损伤[9].磷脂作为细胞膜双分子层中重要的原料物质,能够对生物膜的流动性、通透性和完整性起着重要作用,对骨骼肌运动疲劳等过程中自由基清除、细胞凋亡等具有积极意义[6,8,11].但是尚未发现对急性骨骼肌损伤修复过程中补充磷脂对自由基代谢的影响的相关报道.本研究旨在通过对大鼠腓肠肌钝挫伤后修复过程中补充磷脂对SOD、MDA、CAT及GSH-Px等酶系统影响的研究,探讨补充磷脂对于大鼠腓肠肌钝挫伤后修复过程对于氧自由基反应和脂质过氧化反应的影响.

SOD是人体中一种比较重要的氧自由基清除剂,能将体内超氧自由基转化为过氧化氢,参与人体抗氧化、抗疲劳、抗衰老等等重要生理过程[11],因此常被用作机体抗氧化能力的重要指标.本研究中,补充磷脂在钝挫伤12 h内能提高大鼠腓肠肌SOD活性,同时能预防钝挫伤后2-10天自然愈合组出现的SOD活性急剧下降的过程,从而能长时间提高钝挫伤后腓肠肌SOD活性,有利于腓肠肌钝挫伤后修复过程.因此,补充磷脂能在钝挫伤后恢复的早期(2-10 d)显著提高SOD在机体内的活性,延长机体抵抗氧自由基的能力,从而保护细胞膜免受氧自由基的破坏.

脂质过氧化过程中发生的活性氧物质(ROS)氧化生物膜的过程,即ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物.MDA是ROS氧化的终产物,其含量可反映机体内脂质过氧化的程度及细胞损伤的程度[11].本研究中.PB及NH组中MDA含量在损伤后的2d内,都表现出相对于对照组显著性上升的趋势,但是上升的比例有所不同.至损伤2 d后,PB组MDA含量显著性高于对照组(P<0.01),同时显著性高于PB组(P<0.05)说明自然愈合组内出现大量脂质过氧化反应,这种反应在PB组内得到有效遏制.因此,补充磷脂能在钝挫伤后2 d之内有效控制ROS引起的生物膜、膜受体相关的多不饱和脂肪酸及核算等大分子物质发生脂质过氧化反应,从而降低钝挫伤造成的损害.

CAT是一种酶类清除剂,是生物防御体系的关键酶之一,存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中,它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2,使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH.研究发现,损伤后CAT活性上升主要集中在损伤后24 h之内,同时补充磷脂能促进CAT活性上升,但是与自然愈合组相比,未发现显著性差异.

GSH-Px可以清除由活性氧和-OH诱发的脂质过氧化物,保护细胞膜结构和功能的完整性.大鼠腓肠肌钝挫伤后24 h内,PB及NH组GSH-Px含量较对照组出现上升趋势,说明损伤后24 h内,脂质过氧化水平上升;但是PB组和NH组间未发现显著性差异,说明,损伤后24 h内补充磷脂未能显著降低脂质过氧化水平;至损伤2 d至10 d,PB组GSH-Px活性显著性高于对照组(P<0.01);至损伤后10 d,同时PB组显著性高于NH组(P<0.05).说明,补充磷脂能从大鼠腓肠肌钝挫伤2d后显著性提高GSH-Px活性,从而加快脂质过氧化物清除,保护细胞膜完整性.

4 结论

与损伤后自然愈合组比较,补充磷脂能在大鼠腓肠肌钝挫伤后恢复的2-10d,能显著提高大鼠受损腓肠肌中SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,表明补充磷脂对于清除大鼠受损骨骼肌内氧自由基反应和脂质过氧化反应,加快消除损伤后发生的氧自由基,降低脂质过氧化水平,提高急性骨骼肌钝挫伤恢复效果具有促进作用.

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