利用微卫星标记分析三个品系斑马鱼的遗传多样性＊

傅炳元，郑晓姿，余佳佳，邵晓雨，曹 访，采克俊

（湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州313000）

0 引言

斑马鱼（Danio rerio）具有个体小易养殖、性成熟周期短、繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明等诸多优点，再加上斑马鱼基因组测序工程的完成和其基因与人类基因高度的相似性［1］，使得斑马鱼已成为一种重要的模式脊椎动物，并且广泛地用于发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研究.斑马鱼品系资源丰富，除了野生型品系之外，目前研究人员已经开发出3000多个斑马鱼突变品系和200多个转基因斑马鱼品系.这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用.然而，斑马鱼品系的迅速增加不可避免地带来了品系混杂和不易鉴别的难题.因此，开展斑马鱼的遗传多样性水平的研究，建立斑马鱼品系鉴别体系，对斑马鱼品系资源的保护和合理利用具有重要意义.由于微卫星分子标记广泛分布于真核生物的基因组中［2］，按照孟德尔方式分离，呈共显性遗传，多态性丰富，稳定性较好，引物通用性强［3］，操作简单，应用结果准确有效［4］，其已被作为重要的分子遗传标记应用于品系资源分类及遗传多样性的评估中.目前，有人利用斑马鱼不同染色体上的3个微卫星位点对常用的4种近交系斑马鱼进行了微卫星DNA多态性分析，还有人利用5对斑马鱼STR引物和3对剑尾鱼STR引物对3个封闭群斑马鱼进行STR遗传检测.对不同品系斑马鱼进行STR分析的报道并不多见.本实验对斑马鱼的三个品系进行了遗传多样性的研究，试图从分子水平上为斑马鱼品系确定和类型划分提供分子遗传学依据，为斑马鱼品系资源保护提供理论基础，并为进一步培育新的斑马鱼品系提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 斑马鱼

本实验所用的鱼为从上海燕雪热带鱼养殖厂购得的AB、TU、LF三个品系斑马鱼，其中AB品系为青色，体长4～5cm；TU品系为红色短鳍，体长3～4cm；LF品系为红色长鳍，体长3～4cm，各品系内斑马鱼日龄相近，并且各自的表型也相对一致.先将分多批购买的100条相同品系斑马鱼混养，再分别从各自品系中随机挑选出30条健康的斑马鱼作为实验材料.

1.1.2 试剂

蛋白酶k、rTaq、dNTP、DNA Marker、6×Loading buffer、10×PCR buffer、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、N，N’－亚甲基双丙烯酰胺、硝酸银等均购自Takara公司.

1.1.3 引物

根据魏杰等［5］和穆苑［6］报道，从多对微卫星引物序列中筛选出z9384、z4299、z7382和z20046四对斑马鱼微卫星引物，由上海Invitrogen公司合成.微卫星引物的序列及退火温度见表1.

表1 4个微卫星引物序列及退火温度

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

挑取3个品系斑马鱼各30尾，解剖取得0.2g斑马鱼肌肉组织，用标准酚－氯仿、酒精沉淀的方法提取基因组DNA：将剪碎的肌肉加入6μL蛋白酶k，55℃保温12h以上，消化过夜；加等体积酚抽提1～2次；再用等体积酚∶氯仿∶异戊醇 （25∶24∶1）抽提1次；预冷无水乙醇沉淀；最后用75%乙醇洗涤并干燥后加入TE溶解；置于4℃ 冰箱内保存备用.

1.2.2 微卫星PCR扩增检测

用所选的4对斑马鱼微卫星引物分别进行扩增.PCR扩增体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，10mM dNTPs 2μL，5U／μL Taq DNA聚合酶0.3μL，10μM 的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O17.2μL.反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性20s，58℃ 复性20s，72℃延伸40s，共进行35个循环，最后72℃下延伸7min.产物置于4℃ 冰箱内保存.PCR产物经15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显带，待凝胶晾干后进行拍照.

1.2.3 数据处理及分析

对各品系清晰的条带图谱进行比较，以矩阵形式将数据进行统计并运用POPGEN 32（version 1.32）软件计算得出Shannon指数（I）、Nei基因多样性（h），以及各品系间遗传相似度和Nei氏标准遗传距离，利用PIC＿CALC小软件计算多态信息含量.用MEGA 4.0软件对标准遗传距离采用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析.

1.2.3.1 多态信息含量（PIC ）

多态信息含量是表示微卫星DNA变异程度高低（微卫星座位多态性）的一个指标.

式中Pi、Pj分别为群体中第i、j个等位基因频率，n为等位基因个数.高度多态性座位的PIC值大于0.5；低度多态性座位的PIC值小于0.25；中度多态性座位的PIC值在0.25和0.5之间.PIC和H都能反映群体内个体遗传变异的程度，数值高说明遗传变异就大，反之则群体内的遗传变异小［7］.

1.2.3.2 Shannon信息指数（I）

I＝－∑XiLnXi.

其中，Xi为位点i在某一群体中的出现频率.以上分析采用POPGEN Version1.32软件进行统计，用AMOVA进行遗传变异方差分析，对以上指标进行显著性检验.

1.2.3.3 Nei基因多样性（H）

H＝1－∑X2i.

1.2.3.4 遗传相似度和 Nei氏标准遗传距离（Nei’s genetic distance，Ds）

式中：Ds为标准遗传距离，Xij、Yij为群体X、Y中第r个位点上第k个等位基因的频率，n为检测的位点数［8］.

2 结果与分析

2.1 多态信息含量（PIC）

多态信息含量（PIC）是在连锁分析中一个遗传标记多态性可提供的信息量的度量［9］，在此也可表示为微卫星DNA变异程度的一个指标，反映微卫星多态性的高低.从表2可知，本实验研究的3个微卫星座位z3782、z4299、z9384在AB、LF、TU三个品系斑马鱼上所获得的平均多态信息的含量分别为0.2706、0.3425和0.2369.根据Bostein等提出的多态信息含量指标，0.2706和0.3425分别都落在（0.25、0.5）内，z3782和z4299为中度多态座位；而0.2369落在了（0、0.25）内，z9384为低度多态座位，即z3782和z9384微卫星座位能提供较合理的信息，z9384只能提供较少的信息.

表2 3个微卫星座位的多态信息含量（PIC）

2.2 遗传多样性

利用4个微卫星引物对斑马鱼3个品系共90个个体的DNA样本进行SSR分析，除了z20046只能扩增个别个体的DNA且条带模糊外，其余3个引物z4299、z3782、z9384的扩增产物在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后均条带清晰（图1）.数据计算得到的Shannon信息指数（I）及Nei基因多样性（H）见表3.

图1 微卫星z3782的PCR扩增产物非变性聚丙烯酰胺电泳图谱

表3 3个微卫星座位的多态信息含量（PIC）

由表3可知，各品系的Shannon信息指数有一定差异，其中TU品系的Shannon信息指数最高，为0.5121；AB品系其次，为0.4818；LF品系最低，为0.3498.3个品系的I平均为0.4479，种水平的I为0.5647，Nei基因型多样性（H）种水平为0.3830，在3个品系中的大小顺序与I的大小顺序一致，其变化范围在0.2406到0.3478之间，平均水平为0.3033.由I和H都可解释斑马鱼在物种水平和各品系水平上均有很高的遗传多样性.

2.3 遗传分化

计算的基因多样性及遗传分化系数（见表4），种群内的基因多样性为0.3033，品系间遗传分化系数（Gst）为0.2081.品系内基因多样性所占比例为0.7919，显示斑马鱼品系的变异大部分来自品系内，小部分存在品系间.由Gst所估算的基因流为1.9026.

表4 斑马鱼的基因多样性及遗传分化系数

2.4 遗传距离

利用POPGENE软件计算3个品系间的遗传相似度和遗传距离的结果见表5.由表3可知，3个品系的平均遗传相似度为0.8316，平均遗传距离为0.1890.AB与TU的遗传距离最小，为0.1128；LF与TU的遗传距离也较小，为0.1282；AB与LF的遗传距离最大，为0.3261.根据斑马鱼品系间的遗传距离，采用UPGMA法对3个品系进行聚类，得到树状图（图2）.

表5 3个斑马鱼品系间的遗传相似度和遗传距离

图2 基于Nei’s遗传距离构建的3个品系斑马鱼的UPGMA聚类图

3 讨论

3.1 遗传距离遗传多样性

一般遗传多样性是指狭义上，即种内不同群体和个体间的遗传多态性程度［10］.度量遗传多样性水平的常用指标有Nei基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）.本实验经过软件计算得到Nei基因多样性指数（H）和Shannon信息指数，AB品系分别为0.3215、0.4818；TU 品系分别为0.3478、0.5121；LF品系分别为0.2406、0.3498；种水平分别为0.3830、0.5647.由此得知斑马鱼的AB与TU品系具有较高的遗传多样性，且处于同一水平，而LF品系遗传多样性水平低于其他两者.这是LF品系在地域上有一定程度的隔离或保护，而AB和TU品系与其他品系间杂交现象严重，作为模式生物的斑马鱼在研究要求上将会为取材带来极大的麻烦，故应尽早建立纯系品种养殖基地，重视对纯系斑马鱼资源的保护和开发.

魏杰等［5］采用STR引物扩增的方法分析不同种群在核酸水平上的异同，结果z20046群间差异显著（P＜0.01）及z9384有群间差异（P＜0.5）.穆苑利用微卫星引物z4299和z3782对四个近交系斑马鱼进行了微卫星多态性研究，结果3个微卫星DNA具有稳定扩增效果在不同品系之间表现显著多态性［6］.本实验采用前者的z20046、z9384、z4299和z3782共4对微卫星引物对斑马鱼AB、TU和LF进行扩增检测，结果是z20046扩增效果差，将其弃去.除去引物本身的缺陷，还可考虑到PCR条件是否成熟，其中退火温度尤为重要.PCR中降低退火温度可能增加扩增产量，但引物与模板间的错配现象也会增多，导致非特异性扩增上升［11］.经过数据处理，3对引物即z4299、z3782和z9384在AB、LF、TU三个品系斑马鱼上所获得的平均多态信息含量分别为0.2706、0.3425和0.2369.引物z4299和z3782都坐落在（0.25、0.5）内，均为中度多态座位，而z9384则坐落在（0、0.25）内，给出的信息更少，为低度多态座位.这与穆苑等［6］所得到的z4299和z3782有显著多态性的结果有所差异，而z9384体现的多态性和魏杰［5］的结果基本一致.

3.2 品系间亲缘关系比较

遗传相似性指数和遗传距离是衡量群体间亲缘关系的重要指标［12］.Crawford等［13］指出，若要保存尽量多的遗传多样性，必须有可靠的方法对品种间的遗传分化进行测定，利用微卫星标记的方法将其数据计算所得的遗传距离能够反映分化时间的长短，更能客观地反映本实验中品系间的遗传变异和分化.本实验计算所得结果如下：AB与TU品系的遗传相似性指数及遗传距离分别为0.8933、0.1128；AB与LF品系间分别为0.7218、0.3261；TU 和LF品系间分别为0.8796、0.1282.若个体间遗传相似性指数大于0.5，则为一级亲缘关系；若遗传相似性指数在（0.25，0.5），则为二级亲缘关系.由图2可知，AB与TU品系的分化时间较早，两者与LF品系的分化时间较长.由遗传距离和聚类图可知，AB和TU品系聚为一类，再与LF品系聚到一起.AB与TU品系的遗传分化较小，但3个品系的遗传相似性指数都大于0.5，为一级亲缘关系.这一现象的可能原因是3个品系来源于同一个野生祖先，而最早分化的是LF品系.而AB和TU品系的分化时间可能在同一时期，也可能是被人为诱变的同时期产物.这一想法与美国哈佛大学Wolfgang Driever博士的研究组对斑马鱼进行大规模化学诱变研究，到1996年他们共鉴定出约4000多种斑马鱼突变体，并将Tuebingen品系、AB品系、WIK品系作为研究主要品系不谋而合.而且，斑马鱼基因组计划的所用品系就是Tuebingen品系［1］.

3.3 微卫星分子标记

微卫星作为一种分子遗传标记，拥有较高的个体特异性和可重复性，还能够提供丰富的多态位点及基因座位杂合度和纯合度的遗传信息［14］，故而广泛地应用于群体遗传多样性研究、遗传作图、品种鉴定和群体进化等诸多研究领域.利用微卫星标记也可以分析鱼类的遗传多样性，了解群体间的遗传变异程度，进行群体归类［15，16］；还可以通过分析遗传结构、遗传距离等数据，筛选和培育出具有优良性状的新品种（如耐高温、耐盐性、繁殖力强、生长旺盛等）.

本实验利用微卫星标记对3个品系斑马鱼进行了遗传多样性的分析，计算遗传距离，区分了3个品系在遗传上的差别，进行聚类分析后，最终将其分成2个支系，此方法便捷，准确性高，可为后续更多的新的斑马鱼品系的鉴别和归类提供依据，也为斑马鱼品系资源的保护和合理利用奠定基础.

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