鱼类精子低温冷冻保存研究进展＊

采克俊，曹 访，叶金云

（湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州313000）

0 引言

鱼类是人类食物的重要来源，也是水域生态系统的重要组成部分.鱼类种质资源是进行优良苗种培育、遗传改良和水产养殖业可持续发展的重要物种基础［1］.然而，随着水产养殖业集约化水平的提高，外来养殖品种的引入以及环境的污染、渔业资源的过度开发、养殖鱼类近亲繁殖、水利工程建设等，造成某些鱼类资源的衰退和濒临灭绝，因此鱼类种质资源保护已经迫在眉睫.由于人工活体保种过程具有难度大、复杂且费用昂贵的缺陷，许多国家目前正在对一些主要经济鱼类和珍稀濒危的鱼类种质资源（主要包括精子、卵和胚胎）进行超低温冷冻保存研究，以求达到建立鱼类种质资源库的目的.因为鱼卵和胚胎体积大、含水量多、卵膜通透性差、卵黄含量高，冷冻保存较困难，鱼卵和胚胎的超低温冷冻保存目前尚未取得真正的突破［1，2］.

相比之下，鱼类精子体积小，抗冻剂容易通过，冷冻保存较易成功［3，4］.1953年，英国学者Blaxter首次用干冰冷冻保存了大西洋鲱精子，解冻后授精获得了80%的受精率［4，5］.随后利用液氮冷冻保存鱼类精液的研究在鲤科、鲑科、鲷科等多种鱼类中开展［4］.精子冷冻是目前长期保存鱼类遗传资源的主要途径，引起了人们越来越广泛的关注和重视［1～4］.本文对鱼类精子冷冻保存研究作一综述.

1 鱼类精子超低温冷冻保存的基本原理

超低温冷冻保存是利用超低的温度使细胞新陈代谢停止，但结构保持完整，生命活动处于静止状态，从而达到长期保存的目的.鱼类精子超低温冷冻保存的原理是将精液稀释在渗透压适当的稀释液中，以抑制精子运动，防止精子被激活；同时添加一定浓度的抗冻剂，降低细胞的冰点，防止细胞在冷冻过程中严重脱水和细胞内冰晶形成；采用适当的降温速率，使精子安全越过冰晶形成区，进入液氮温区（－196℃）；采用合适的复苏方法，冷冻的鱼类精子仍然能够恢复生命活动［1，2］.

与高等动物不同，鱼类精子在精巢中受到渗透压抑制而不运动，一旦与其生存水环境接触，渗透压改变，便立即被激活，开始运动.鱼类精子很少利用外界的能源，激活后主要靠消耗其本身贮存的能量维持运动和渗透平衡.由于其贮存的能量很少，因而其激活后运动的时间非常短（从数秒至数分钟）［1］.所以，要长期保存鱼类精子，必须减少或停止精子的能量消耗，亦即停止精子的运动和代谢.鱼类精子没有哺乳动物精子的冷休克现象.因此，除了筛选不会使精子激活的防冻液外，在低温下（4℃左右）稀释和平衡也是减少精子运动的有效途径之一.总体来说，鱼类精子冷冻保存操作简便，效果较好.但不同鱼类精子的生理特性存在差异，需要筛选最优的冷冻方案，以减少冷冻损伤带来的危害［3］.

2 防冻液

鱼类精子冷冻首先要将精液稀释于防冻液中，平衡一段时间后再进行降温冷冻.防冻液主要包括两大类：稀释液和渗透性抗冻剂.

2.1 稀释液

稀释液主要由无机盐（如NaCl、KCl、NaHCO3、KHCO3和柠檬酸钠等）和非渗透性抗冻剂组成.非渗透性抗冻剂是一类不能透过细胞膜的大分子物质，主要有糖类，如葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖等；脂类，如磷脂、胆固醇；蛋白质类，如卵黄、脱脂奶粉、小牛血清、抗冻蛋白等，以及其他添加剂，如氨基酸、抗氧化剂、抗生素等［6～15］.

表1 一些鱼类精子冷冻所用的稀释液、渗透性抗冻剂

稀释液能够为精子提供一个合适的渗透压和pH值环境，并为精子提供能量，防止细菌污染，减轻高度稀释对精子的负面影响，延长精子的存活时间，增加细胞膜结构的稳定性和缓解冷冻损伤.稀释液的配制是鱼类精子冷冻保存中的一个关键步骤.稀释液的成分应该对精子没有毒性，或者毒性很小，而且不会激活精子，使精子保持静息状态.一般认为稀释液在合适的渗透压范围内，成分越简单越好.已用过的一些鱼类精子冷冻保存稀释液，如表1所示.稀释液的成分到目前为止仍然没有一个统一的定论.应根据不同鱼类精子特性进行逐个试验筛选［6］.

2.2 渗透性抗冻剂

渗透性抗冻剂是一类含有－羟基的小分子化合物，如甘油（Gly）、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）、乙二醇甲醚（MG）、甲醇（MEOH）、二甲基甲酰胺（DMF）和乙酰胺（DMA）等（表1）.这些抗冻剂可以自由通过细胞膜，在溶液中容易发生水合作用，增加溶液的粘性，弱化水的结晶过程，减缓低温下精子细胞的收缩，从而达到保护的目的.加入适当的抗冻剂，可以提高精子渗透压，降低其冰点，有效减少精子冷冻保存过程中带来的冰晶损伤.

1949年，英国Polge和Smith首先用Gly冷冻保存牛精子获得成功［16］，随后Gly被广泛应用于多种动物精子的冷冻保存，并且被证明是一种有效的抗冻剂.一些海水鱼类用Gly冷冻保存效果较好，但很多报道证明Gly对于淡水鱼类精子的冷冻保存效果不佳.目前发现，DMSO是比较有效的鱼类精子冷冻抗冻剂，10%的DMSO是一个高度有效的浓度，既能起到良好的抗冻作用，又不会因抗冻剂浓度过高而导致精子中毒，适合于多种鱼类精子冷冻保存［1，3，6～9，13，14］.但也有人认为 EG 或者 MG 可以代替 DMSO.不同的鱼类精子有着不同的特性，其细胞膜对每种抗冻剂的通透性不同，因而适用的抗冻剂也是不相同的，有必要进行特异性筛选.并且，由于抗冻剂本身对细胞有毒害，因此抗冻剂的浓度对精子冷冻的保护作用与对精子的毒性之间存在着相互制约的关系.在两者之间找到一个最适搭配，是选择抗冻剂的关键所在.因此，在鱼类精子冷冻保存时确定最适的抗冻剂种类和浓度非常重要.

3 降温速率

相对于细胞膜的渗水性而言，降温速率分为快速降温和慢速降温两种.若用快速降温，细胞内的水分未能渗出，形成的冰晶会损伤细胞膜，导致精子死亡.慢速降温，精子可以充分脱水，与周围高渗溶液保持渗透压平衡，胞内冰就不容易形成.如果降温速率过慢，精子就会长期处于高渗溶液中，导致细胞收缩，出现溶质损伤.因此，筛选最佳的降温速率对提高冷冻保存效果至关重要.目前鱼类精子冷冻多采用分段慢速降温法，即精液在4℃平衡后，将冻存管在液氮面上1～10cm高度放置熏蒸2～10min，然后在液氮面上放置一段时间或者直接投入液氮中［1，3，6，11］；也有用程序冷冻仪控制完成降温过程.慢速降温法有利于鱼类精子对低温的适应，能够在冻结前充分脱水，减少冰晶形成，安全越过－15℃至－60℃这段危险温度区.

最近两年，关于鱼类精子快速降温，即玻璃化冷冻保存获得了成功.快速降温是为了避免冷冻过程中细胞内冰晶的形成，而是形成无结构的玻璃态［17］.该方法冷却速率快，很多情况下需要增加渗透性抗冻剂的浓度，需要选择对细胞毒性小的渗透性抗冻剂，或者完全不添加渗透性抗冻剂.这是目前研究精子玻璃化冷冻的重点方向.Merino等采用无渗透性抗冻剂的防冻液，将20μl稀释精液直接丢入液氮表面，玻璃化冷冻虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）精子获得了成功［18］.Cuevas－Uribe等较系统研究了鱼类玻璃化冷冻的影响因素，并率先用玻璃化冷冻的斑点叉尾鮰精子繁殖出后代［19］.玻璃化冷冻法在鱼类精子冷冻保存上的应用才刚刚起步.与常规冷冻方法相比较，玻璃化冷冻方法操作快速简单，不需要昂贵的设备，因此它在鱼类精子冷冻保存上有很大的应用潜力.

4 鱼类精子冷冻的应用

4.1 鱼类种质资源保护

鱼类精液冷冻保存与雄核发育技术的结合，为保存珍稀、濒危鱼类基因型、恢复物种开辟了一条新的途径［4］.利用精子超低温冷冻方法，将珍稀濒危或者名贵优良的鱼类精子冷冻保存起来，建立相应的鱼类精子库，待需要时再解冻进行雄核发育，就可以达到长期保存鱼类种质资源和遗传多样性的目的［4］.同时也可以通过人工交配不同繁殖期或地理间隔的种系来扩大杂交组合的范围，保护生物多样性.此外，鱼类精子冷冻在模式生物的资源保存上越来越受到重视.比如，斑马鱼是一种理想的实验动物.除了野生型品系之外，目前研究人员已经开发出3000多个斑马鱼突变品系和200多个转基因斑马鱼品系.这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用.如何安全、妥善地长期保存这些品系是每一个研究斑马鱼的实验室都会面临的问题［20］.因为人工活体保种过程具有难度大、复杂且费用昂贵的缺陷，许多国家的学者目前正在对斑马鱼进行精子超低温冷冻保存研究，以求达到建立斑马鱼精子库，进行长期保种的目的，解决了各种斑马鱼品系的长期保种和繁育不可避免地带来了“住宿紧张”和“资金紧张”的难题.这类方法一般是通过体外挤出精子或研磨精巢获取新鲜的精子，用适量的防冻液混匀后，分装保存在液氮罐中［20］.

4.2 鱼类遗传育种

在非生殖季节，可以诱导雌鱼产卵，用雄鱼保存的冻精授精，提前繁殖出鱼苗.通过精子冷冻保存，可以使不同生殖周期或地理隔离的鱼类品系得以交配，解决雌雄性成熟不同步的问题.例如，赤点石斑鱼是一种重要的水产养殖经济鱼类，也是世界自然联盟红色名单中的濒危鱼种.它是一种雌雄同体，雌性先熟的鱼类，要经过很长一段时间才能发育为成熟雄性，目前野外捕捞到的雄性赤点石斑鱼数量锐减.而雌、雄鱼成熟不同步成为该鱼种人工养殖上的难题.超低温冷冻可以将过剩的雄鱼精子细胞进行保存，保证雌鱼受精能够随时进行［21］.对于那些体型较大的鱼类，活体长途运输很不方便，利用冷冻精子，就可以方便地运输.通过将不同的多品种鱼类精子冷冻保存在鱼类精子库中，还可以为鱼类杂交育种、雌核发育、性别控制、转基因等生物技术研究不间断地提供材料，对水产养殖业会产生巨大而深远的影响［1，4］.

5 总结与展望

近年来，国内外在鱼类精子的冷冻保存和生产应用方面取得了极大的成就.但是鱼类冻精的活力和受精率很难达到鲜精的水平.因此，鱼类精子超低温保存研究还有待进一步深入和完善.筛选更适宜的稀释液配方以及寻找更为有效的防冻剂，采用最优的降温速率是有效保护精子受精能力的重要措施，同时也是今后进一步研究的重点.抗冻蛋白的应用，以及冷冻过程中鱼类精子细胞膜脂质改变的研究也受到了重视［21，22］.鱼类精液冷冻保存方法的优化，需要针对鱼类精子细胞膜对水和防冻剂的通透性、对渗透压的耐受性、细胞体积与表面积之间的关系等基础低温生物学特性进行更深入的研究.同时由于鱼类精子具有独特的激活机制，还要加强对冷冻过程中线粒体的损伤机制及鱼类精子运动分子机理进行深入研究.

我国已经对青、草、鲢、鳙、鲤等十余种淡水养殖鱼类和牙鲆、大菱鲆、真鲷、黑鲷、半滑舌鳎等十余种海水养殖鱼类建立了精子保存技术的操作规程，对精液进行批量冷冻保存，建立了多个鱼类精子库.但我国作为渔业资源大国，还有众多的鱼类精子冷冻需要研究.相信，随着研究手段的不断进步和研究的不断深入，鱼类精子冻存技术将日臻完善，必将极大地促进鱼类种质保存与优良种质培育.

［1］陈松林.鱼类精子和胚胎冷冻保存理论与技术［M］.北京：中国农业出版社，2007.

［2］Robles V，Cabrita E，Herráez M P.Germplasm cryobanking in zebrafish and other aquarium model species［J］.Zebrafish，2009，6（3）：281～293.

［3］Cabrita E，Sarasquete C，Martínez－Páramo S，et al.Cryopreservation of fish sperm：applications and perspectives［J］.J Appl Ichthyol，2010，26（5）：623～635.

［4］陈松林.鱼类配子和胚胎冷冻保存研究进展及前景展望［J］.水产学报，2002，26（2）：162～169.

［5］Blaxter J H S.Sperm storage and cross－fertilization of spring and autumn spawning herring［J］.Nature，1953，172：1189～1190.

［6］Irawan H，Vuthiphandchai V，Nimrat S.The effect of extenders，cryoprotectants and cryopreservation methods on common carp（Cyprinus carpio）sperm［J］.Anim Reprod Sci，2010，122（3～4）：236～243.

［7］Cabrita E，Robles V，Herraez M P.Cryopreservation of rainbow trout sperm in large volume straws：application to large scale fertilization［J］.Aquaculture，2001，201：301～314.

［8］Viveiros A T，Godinho H P.Sperm quality and cryopreservation of Brazilian freshwater fish species：a review［J］.Fish Physiol Biochem，2009，35（1）：137～150.

［9］Asturiano J F，Perez L，Marco－Jimenez F，et al.Media and methods for the cryopreservation of European eel（Anguilla anguilla）sperm［J］.Fish Physiol Biochem，2003，28：501～502.

［10］Rideout R M，Litvak M K，Trippel E A，The development of a sperm cryopreservation protocol for winter flounder Pseudopleuronectes americanus（Walbaum）：evaluation of cryoprotectants and diluents［J］.Aquac Res，2003，34：653～659.

［11］Rideout R M，Trippel E A，Litvak M K.The development of haddock and Atlantic cod sperm cryopreservation techniques and the effect of sperm age on cryopreservation success［J］.J Fish Biol.2004，65：299～311.

［12］Maria A N，Viveiros A T M，Freitas R T F，et al.Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba（Brycon orbignyanus）semen，an endangered Brazilian teleost fish［J］.Aquaculture，2006，260（1～4）：298～306.

［13］Huang C J，Dong Q X，Walter R B，et al.Initial studies on sperm cryopreservation of a live－bearing fish，the green swordtail Xiphophorus helleri［J］.Theriogenology，2004，62（1～2）：179～194.

［14］叶霆，竺俊全，杨万喜，等.黑鲷精子的超低温冻存及DNA损伤的SCGE检测［J］.动物学研究，2009，30（2）：151～157.

［15］王晓爱，杨晓君，陈小勇，等.软鳍新光唇鱼精子的超低温冷冻保存［J］.动物学研究，2012，33（3）：283～289.

［16］Polge C，Smith A U.Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperature［J］.Nature，1949，164：666.

［17］Rall W F，Fahy G M.Ice－free cryopreservation of mouse embryos at－196degrees by vitrification［J］.Nature，1985，313（6003）：573～575.

［18］Merino O，Risopatrón J，Sánchez R，et al.Fish（Oncorhynchus mykiss）spermatozoa cryoprotectant－free vitrification：stability of mitochondrion as criterion of effectiveness［J］.Anim Reprod Sci，2011，124（1～2）：125～131.

［19］Cuevas－Uribe R，Leibo S P，Daly J，et al.Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non－equilibrium cooling［J］.Cryobiology，2011，63（3）：186～197.

［20］郑乃中，张博.斑马鱼精子冻存与复苏实验方法与流程［J］.遗传，2012，34（9）：1211～1216.

［21］He Q T，Lu G，Che K，et al.Sperm cryopreservation of the endangered red spotted grouper，Epinephelus akaara，with a special emphasis on membrane lipids［J］.Aquaculture，2011，318（1～2）：185～190.

［22］Beirão J，Zilli L，Vilella S，et al.Improving sperm cryopreservation with antifreeze proteins：effect on gilthead seabream（Sparus aurata）plasma membrane lipids［J］.Biol Reprod，2012，86（2）：59.