黄瓜雌性性状的QTL定位分析

厉建梅，辛 明，秦智伟，武 涛，周秀艳

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

黄瓜（Cucumis sativus L.）在自然群体中存在纯雌株、强雌株、纯雄株（或强雄株）、雌雄同株、纯全株、雌全雄同株、全同株、雌雄全同株等8种不同的性型[1-2]，其性别类型复杂多样，被认为是研究植物性别决定的经典模式植物。黄瓜全雌性是保护地黄瓜品种选育中重要的目标性状，而且利用全雌性品系配制一代杂种无需人工去雄，可极大地简化杂交种的生产程序。有关黄瓜雌性性状分子标记已有相关报道，时秋香等获得与黄瓜性别决定基因M紧密连锁的三个共显性标记：SSR19914、SSR23487、SCAR123，其中 SSR19914与SCAR123位于M基因同侧，与M基因遗传距离分别为3.2和0.94 cM，SSR23487位于M基因另一侧，与M基因遗传距离为0.28 cM，从而最终将M基因定位于1.22 cM的遗传区间内[3]。苗晗等利用F9代RILs群体进行复雌花QTL定位分析[4]。共检测到8个控制复雌花性状的QTL，分布在第1、2、3、6、7染色体上。位于第3染色体的Mp3.2贡献率最大；位于第6染色体的Mp6.2在春秋两季位置都很稳定。获得紧密连锁（＜10 cM）的特异标记（SSR04635、 SSR13466、 SSR00584、 SSR10449）4个。

本试验参照已构建的黄瓜高密度遗传图谱[5]，试图找到更多与黄瓜雌性性状紧密连锁的分子标记，以期为开展黄瓜雌性性状研究和分子辅助选择育种提供技术支持，为黄瓜雌性系和新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料均由东北农业大学园艺学院黄瓜课题组提供，包括有雌性系P1（D0420）、强雄株系P2（D06103）、组合“D0420×D06103”及组合“D0420×D06103”构建的 F2、B1、B2群体，所得的6 个参试世代为 P1、P2、F1、F2、B1、B2。

1.2 试验方法

试验在东北农业大学香坊实验实习基地温室内进行。亲本材料于2009年3月1日播种育苗，4月15日定植于日光温室，两行区，株行距35 cm×60 cm，每区定植36株，常规管理。

2009年7月初采收的F1组合种子热处理后，于7月15日播种育苗。8月15日定植，每区定植36株。将其F1组合D0420×D06103自交获得F2代，并将F1世代分别与两个亲本回交，获得（D0420×D06103）×D0420和（D0420×D06103）×D06103两个回交世代。2010年3月2日春播种6个世代，4月18日定植。

1.3 性型调查

性型调查样本容量：每个亲本15株，F1组合45株，F2202株、B174株、B279株。

黄瓜花性型调查方法：当植株长到10节以上时，统计10节以下每节所开花的性型，当植株长到20节以上时，统计10～20节每节所开花的性型，植株长到30节以上时，统计20节以上每节所开花的性型。雌花节率：结果盛期，主蔓上着生雌花的节位数占总节位数的百分率[6]。雌花节率（%）＝主茎25节内雌花节数+雌雄混合节数/25节×100%。

1.4 DNA提取及近等基因池的构建

黄瓜叶片总DNA提取采用CTAB法[7]，略有改动，提取的DNA在含有0.5 μg·mL-1EB的1%琼脂糖凝胶中电泳30 min，UVP凝胶成像系统进行拍照记录；从F2分离群体中选取雌花节率处于两个极端的各10个单株的DNA，将同类型单株的DNA进行混合，构建全雌、强雄基因池用于筛选在亲本中有多态性的标记。

1.5 PCR反应及其电泳检测

SSR 反应体系为 20 μL，其中含有 11.3 μL ddH2O，2.0 μL 10 ng·μL-1的模板，0.25 μL 10 pmol·μL-1的引物，2.0 μL 2.5 mmol·L-1的 MgCl2，2.0 μL 10×buffer，2.0 μL 2 mmol·L-1dNTP， 0.2 μL 2.5 U·μL-1Taq DNA聚合酶。PCR扩增反应程序：94℃预变性6 min；94℃变性30 s；56℃（因引物而异）退火1 min；72℃延伸1 min；35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、银染和记录带型。

1.6 连锁分析

分子标记的记录采用常规的Mapmaker软件记录方法—ABH法。父本型D06103的纯合带型记为A，母本型D0420的纯合带型记为B，两亲本的杂合带型记为H，数据缺失或模糊不清的记为“-”，用卡方检验法对统计得到的F2群体中SSR带型分布结果进行分析。使用Mapmaker/EXP V3.0b遗传连锁分析软件构建连锁群，使用MapChart作图软件生成连锁图。

1.7 QTL定位

使用Windows QTL Cartographer V2.5遗传位点构图软件进行QTL定位。将“.map”和“.raw”文件导入软件，生成“.mcd”格式文件。对“.mcd”文件数据采用复合区间作图法进行QTL扫描定位，以似然比LR（Likehood ratio）大于11.5，即LOD值大于2.5作为QTL存在的阈值。

2 结果与分析

2.1 黄瓜雌性性状遗传分析

雌性系 P1（D0420）和强雄性系 P2（D06103）杂交、自交及回交6个世代的雌花节率调查结果列入表1。P1、P2雌花节率的次数分布具有明显差异，F1代平均值为80.6%，趋向于雌性系亲本P1，即大部分表现强雌株，全雌性对强雄性表现为不完全显性特征，B1代呈单峰分布，B2及F2代呈双峰连续分布，且B2及F2代变异范围较大，表明控制全雌性状有主效基因，还存在着微效基因的影响；雌花节率频次分布如图1所示，偏度＝│-0.97│＜1，而峰度Kurtosis＝0.72，表现出偏向两侧，呈现偏态分布。

表1 黄瓜组合（D0420×D06103）6世代雌花节率的次数分布Table1 Frequency distribution of female flowers proportion in six generations of combination D0420×D06103

图1 D0420×D06103组合的F2群体雌花节率次数分布Fig.1 Frequency distribution of female flowers proportion of F2isolated population of combination D0420×D06103

2.2 多态性引物的筛选

本研究选用214对SSR引物，通过父本D06103和母本D0420组合的筛选，两亲本间具多态性的引物为51对，多态率为23.83%，进一步利用这51对引物对全雌和强雄2个基因池筛选，得到21个多态性引物标记，6%变性聚丙烯酰胺凝胶筛选结果见图2。

2.3 黄瓜遗传连锁图谱的构建

SSR为共显性标记，根据孟德尔遗传规律，每个多态性标记在F2群体中的分布均应符合1∶2∶1的理论值，基因频率均应符合1∶1的期望比。对获得的21个多态性位点在F2群体的分离数据进行X2适合性检测，由卡方检验结果可知，3个标记带型分布出现了偏分离（CSWCT13Balt、CSWCT17、SSR23265、SSR29622），比率为14.29%。对获得的21个多态性标记位点进行连锁分析，构建遗传连锁图，其中20个标记位点进入4个连锁群（LOD≥2.5），1个位点（CSWCT11）未定位到连锁群上，连锁群总长度为98.5 cM，标记间平均距离4.9 cM，最短的连锁群0.5 cM（LG1），最长的连锁群53.4 cM（LG2）；标记间最小距离0.2 cM，最大距离25.2 cM，标记总体在整个连锁群中分布比较均匀，没有标记聚集在一起的现象。用MapChart软件生成连锁群如图3所示。

图2 引物SSR11633在F2群体中SSR扩增产生的带型Fig.2 SSR amplification results generated by prmier SSR11633 in the F2population

图3 使用D0420×D06103的F2群体构建的遗传连锁群Fig.3 Linkage group based on the F2population from the cross D0420×D06103

2.4 黄瓜雌性性状的QTL定位

用Windows QTL Cartographer V2.5软件以复合区间作图法进行QTL分析，在连锁群LG3共检测出2个与黄瓜性状相关的QTL（QTL1，QTL2）：SSR00134-QTL1-SSR18956、SSR15482-QTL2-SSR21936（见表2）。QTL1距离标记SSR00134较近，为2.1 cM，LOD值为50.04，可解释15.36%的表型变异；QTL2距离标记SSR21936较近，为1.4 cM，LOD值为6.48，可解释5.69%的表型变异。QTL位点加性效应值分别为0.38和0.12，对提高黄瓜雌性性状来说表现为增效加性效应。QTL在目标连锁群上的位置如图4所示。

表2 黄瓜雌性性状QTL分析Table2 QTL analysis of gynoecious in cucumber

图4 黄瓜雌性QTL定位Fig.4 QTL localization of gynoecious of cucumber

3 讨论

偏分离是指遗传标记的观察频率偏离预期频率的现象，对单个位点遗传标记的试验数据进行经典的X2检测可以发现，偏分离是遗传标记的一种普遍现象[9]，并被认为是生物进化的动力之一。本试验的F2群体的表型观察也偏向于双亲，可能是在构建群体时，定植的过程中虽然是每一号植株随机拿取一株，但也可能存在一定的误差。偏分离机制是非常复杂的，目前主要归纳为以下几点：①遗传搭车效应，与配子体选择基因相连锁的标记位点可能产生偏分离；②在分子标记连锁图上存在偏分离的热点区域（Segregation distortion region，SDR），在这些区域可能有与偏分离相关的特定基因；③染色体片段的重组和倒位，造成减数分裂时期染色体不配对或亲和力降低，减少重组率，使连锁分离产生偏离；④环境因素、非同源重组、基因转换、转座因子等可能引起标记位点的偏分离；⑤标记位点数据缺失导致的偏分离；⑥作图群体亲本某些位点的杂合；⑦群体构建过程中的人为选择也会造成部分偏差等[10-11]。本研究的F2群体的偏分离究竟是受哪些原因的影响，有待于进一步深入研究。

SSR技术被认为是构建真核生物高度饱和遗传图谱的标准分子标记[12]。本研究检测得到与黄瓜雌性性状相关的QTL位点2个：SSR00134-QTL1-SSR18956、SSR15482-QTL2-SSR21936，距离最近的标记分别为2.1和1.4 cM，具有一定的代表性。试验检测到的QTL位点距离两侧标记的距离较大，还应继续开发、加大引物密度，同时此QTL位点的贡献率为15.36%和5.69%，说明此位点对黄瓜雌性代表性一般，应进一步筛选引物，找到与目标性状紧密连锁的标记。此外，本试验采用F2分离群体、214对引物进行QTL定位，虽然检测到了QTL位点，但检测到的QTL是否是“一致性QTL”尚不能确定，本试验只进行了一个季节的QTL定位，由于F2群体是暂时性群体，难以用其进行重复性研究，将来的试验过程中可以采用永久性群体（如重组自交系RIL）进行检验。

黄瓜雌性性状与产量密切相关，但是由于黄瓜的开花结果期持续时间长，传统方法对雌性状进行表型选择极为耗时。而通过分子标记辅助育种，利用与性状紧密连锁的分子标记，在复杂的环境影响中进行辅助育种是改良作物复杂性状的有效手段[13-14]。在植株生长早期进行选择，则能大大缩短育种周期，提高育种效率。在黄瓜中，Fazio等已证明对于侧枝、瓜长径比和雌花率的分子标记辅助选择是有效的（侧枝：每轮选择大约0.3个；长径比：每轮选择大约增加0.1个单位；雌花比率：每轮选择增加5.6%～9.8%）[13,15]。选择其中稳定且高贡献率的位点进行进一步的MAS试验将是一项非常有效的工作。本研究中QTL定位结果为进行分子标记辅助选择，实现雌花优良等位基因的快速转移奠定基础。

4 结论

本研究以黄瓜雌性系D0420×强雄性系D06103的211株F2单株为作图群体，应用SSR分子标记技术，得到与黄瓜雌性性状相关的标记位点21个，分属4个连锁群，连锁群全长为98.5 cM，标记间平均距离4.9 cM，最短的连锁群0.5 cM（LG1），最长的连锁群53.4 cM（LG2）；标记间最小的遗传距离0.2 cM，最大的遗传距离25.2 cM；采用复合区间定位分析，检测到与黄瓜雌性性状相关的QTL位点2个，均位于第3连锁群上，距离最近标记的遗传距离分别为2.1和1.4 cM，LOD值分别为50.04和6.48，贡献率分别为15.36%和5.69%。

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