抗性淀粉测定方法的研究

薛 慧，张国治，吕飞杰，台建祥，吕小文

(1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450052；2.中国农业科学院 作物科学研究所，北京 100081; 3.中国农业科学院 饲料研究所,北京 100081)

抗性淀粉测定方法的研究

薛 慧1，2，张国治1，吕飞杰2*，台建祥2，吕小文3

(1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450052；2.中国农业科学院 作物科学研究所，北京 100081; 3.中国农业科学院 饲料研究所,北京 100081)

抗性淀粉的测定方法有Berry法、Englys法、Bjorck法、Champ法、Goni法等.以木薯抗性淀粉和抗性淀粉标准品为原料，通过对抗性淀粉的处理方法（AOAC法、Goni法）以及还原糖的测定方法（3,5-二硝基水杨酸法、D-葡萄糖法）进行对比，得到木薯抗性淀粉最适合的测定方法.同时也研究了样品多少对测定结果的影响.结果表明，AOAC-GOPOD法操作简单、准确性高、重复性好，酶用量充足，是测定木薯抗性淀粉的首选方法.

木薯；抗性淀粉；测定方法

0 引言

抗性淀粉（resistant starch）是指在小肠内不能消化，但在大肠内可以发酵的淀粉.抗性淀粉是一种不溶性的膳食纤维，但它与可溶性的膳食纤维性质相近，如瓜尔胶［1］.研究表明：抗性淀粉可以降低甘油三酯和胆固醇的浓度，改善肠道菌群，预防直肠癌和肠道疾病，防止糖尿病，控制体重，促进维生素和矿物质的吸收.此外，抗性淀粉不会影响食品的风味、质地和外观，甚至可以提高最终产品的风味.因此，抗性淀粉可作为功能性成分添加于谷物早餐、面包等普通食品以及糖尿病人食品和减肥食品中［2-5］.目前国外对抗性淀粉的研究很深入，而国内尚处于起步阶段.抗性淀粉的测定在近20年的研究中出现了许多方法，结果千差万别，一些方法本身不稳定、重现性差.因此，研究抗性淀粉的测定方法具有非常重要的作用.抗性淀粉的测定方法主要有Berry法、Englys法、Bjorck法、Champ法及其改良法、Goni法.国外通常用AOAC法测定抗性淀粉的含量，国内一般采用Goni法.AOAC法和Goni法在测定抗性淀粉含量时，相同点都是先去除可溶淀粉，然后水解抗性淀粉，再测定抗性淀粉中还原糖的含量，最后换算成抗性淀粉的含量.根据抗性淀粉的处理方法，可分为AOAC法和Goni法.根据还原糖的测定方法，又可分为3,5-二硝基水杨酸法（DNS）和D-葡萄糖法（GOPOD）.故抗性淀粉的测定方法有AOAC-GOPOD、AOAC-DNS、Goni-GOPOD、Goni-DNS 4种.本文以木薯抗性淀粉和抗性淀粉标准品为测定对象，对4种方法进行对比，旨在寻找适合木薯抗性淀粉的测定方法.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木薯淀粉：广西崇左市群力淀粉有限责任公司；抗性淀粉试剂盒：爱尔兰Megazyme公司；胃蛋白酶：Amresco公司；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶：丹麦诺维信公司；3，5-二硝基水杨酸、无水葡萄糖、酒石酸钾钠、亚硫酸氢钠等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

DKZ-450B型恒温振荡水槽：上海森信实验仪器有限公司；Sorvall RC 5C Plus离心机：美国Sorvall公司；GI54D高压灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；HH-S21-4-S电热恒温水浴锅：上海博泰实验设备有限公司；791型磁力电热搅拌器：上海南汇电讯器材厂；HYQ-3110涡旋混匀器：南京畅翔仪器设备有限责任公司；AL104分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FW177中草药粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；752紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HI98103笔式pH计：意大利Hanna公司；DF205电热鼓风干燥箱：北京西城医疗机械二厂.

1.3 试验方法

1.3.1 抗性淀粉的制备方法

将一定量的木薯淀粉与水按1∶9混合，搅拌均匀，密封放入高压灭菌锅内，120℃处理20 min，4℃静置24 h，70℃烘干16 h，粉碎，过100目筛.

1.3.2 AOAC法测定抗性淀粉的步骤

准确称取100 mg样品，加入4.0 mL α-胰淀粉酶（其中含有AMG 12 U），37℃连续振荡16 h，取出，加入4.0 mL无水乙醇，离心(1 500 g，10 min），倒出上清液，沉淀用50%的乙醇至少洗涤2次，合并上清液.将沉淀冰浴，加入2 mL 2 mol/L的KOH，磁力搅拌，然后加入8 mL 1.2 mol/L的醋酸钠缓冲液（pH3.8），混匀，立即加入0.1 mLAMG，50℃水浴30 min.对于RS含量＜10%的样品，将处理后的溶液直接离心（1 500 g，10 min）.对于RS含量＞10%的样品，根据抗性淀粉的含量定容溶液，取少量溶液离心（1 500 g，10 min）［6-8］.用DNS法和GOPOD法测定还原糖的含量.

1.3.3 Goni法测定抗性淀粉的步骤

称取100 mg的样品，加入10 mL KCl-HCl缓冲液和胃蛋白酶溶液，40℃振荡1 h，取出添加加入9 mL 0.1 mol/L Tris-maleate缓冲液，用HCl或者NaOH调节pH为6.9，加入α-淀粉酶，37℃水浴振荡16 h，离心（3 000 g，15 min），倒出上清液，用蒸馏水洗涤后，再次离心，合并上清液，重复上述洗涤沉淀和离心步骤.加3 mL的蒸馏水于离心管中，再加入3 mL 4 mol/L KOH溶液，室温振荡30 min，加5.5 mL 2 mol/L HCl和3 mL 0.4 mol/L醋酸钠缓冲液，调节pH为4.75，加葡萄糖淀粉酶，60℃水浴振荡45 min，离心，收集上清液于容量瓶中，用蒸馏水洗涤沉淀，离心，合并上清液.根据抗性淀粉的含量定容溶液［9-10］.用DNS法和GOPOD法测定还原糖的含量.

1.3.4 DNS法测定抗性淀粉的步骤

1.3.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准溶液：称取大于100 mg的葡萄糖，103℃干燥至恒重，准确称取100 mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，并定容至1 000 mL［11］.

DNS显色剂的配制：将1.575 g%3，5-二硝基水杨酸和65.5 mL 2 mol/L NaOH溶液溶解于125 mL含有46.25 g酒石酸钾钠的热溶液中，搅拌均匀，再加入1.25 g结晶酚和1.25 g亚硫酸钠，冷却后用蒸馏水定容至250 mL，摇匀后转移至棕色瓶中，放置1周后备用［12］.

取7支25 mL的具塞试管，按表1混合，再分别加入1.5 mL的DNS溶液，将各试管摇匀后，在沸水浴中加热5 min，取出后迅速流水冷却，以蒸馏水定容至25 mL，在540 nm下，以1号管调零，测量2至7号管的吸光度，以吸光度为横坐标，以葡萄糖含量为纵坐标，绘制标准曲线.

表1 葡萄糖标准溶液的配制

1.3.4.2 DNS法测定抗性淀粉的含量

取1 mL的上清液于25 mL的试管中，加入1 mL蒸馏水和5 mL DNS，将各试管摇匀，在沸水浴中加热5 min后，用流水迅速冷却，再用蒸馏水定容至25 mL，测量各溶液的吸光度，利用标准曲线计算出葡萄糖的含量，根据下列公式计算抗性淀粉的含量：

式中：M为葡萄糖含量（由葡萄糖标准曲线求得）；W=分析样本的干质量=质量×（100-含水量）/100.

1.3.5 GOPOD法测定还原糖含量的步骤

取0.1 mL上清液于试管中，加入3.0 mLGOPOD试剂，50℃孵育20 min.以0.1 mL醋酸钠缓冲液（pH4.5）和3.0 mL GOPOD为空白试剂，以0.1 mL D-葡萄糖（1 mg/mL）和3.0 mL GOPOD为葡萄糖标准溶液，在510 nm下测量溶液相对于空白试剂的吸光值.抗性淀粉（g/100 g样品）（样品包含＞10%RS）=ΔE× F/W×待测液的体积×0.9，

式中：ΔE为相对于空白试剂的吸光度值；F=100（D-葡萄糖的μg数）/100 μgD-葡萄糖的吸光度值.

2 % 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线(图1)

2.2 准确性的比较

分别对抗性淀粉含量为53.2%的标准品采用不同的方法测定，结果见表2.

从表2可以看出，Goni法比AOAC法的测定结果偏高，这可能是由于Goni法在酶解可溶性淀粉时未使用葡萄糖淀粉酶导致可溶性淀粉水解不彻底，从而使得测定结果偏高.同时，采用GOPOD法比DNS法测定的还原糖含量偏高，这是由于DNS法测定过程中的诸多影响因素，如吸收波长的大小、显色时间、显色剂用量等都会对测定结果的准确性产生影响.该标准品测定结果的允许误差为±5%，57.583%和51.42%恰好在这一范围内，故AOAC-GOPOD和AOAC-DNS的准确性

图1 葡萄糖标准曲线

表2 测定方法准确性的比较

比较高.

2.3 重复性的比较

对抗性淀粉标准品和木薯抗性淀粉分别采用不同的方法测量3次，测量结果见表3和表4.

表3 测定方法重复性的比较 （标准品）%

从表3看出，对于抗性淀粉含量比较高的样品来说，AOAC-GOPOD和AOAC-DNS的重复性比较好.从表4看出，经过压热-冷却处理之后的木薯抗性淀粉的含量比较低，采用AOAC-DNS法测定结果重复性不好，故对于木薯这类抗性淀粉含量较低的样品，抗性淀粉的测定方法采用AOAC-GOPOD为好.

表4 淀粉测定方法重复性的比较（木薯抗性淀粉）%

2.4 样品多少对测量结果的影响

准确称取100 mg和400 mg的样品，分别采用4种不同的方法进行测定，结果见表5.%

表5 样品多少对测量结果的影响%

从表5看出，当样品为400 mg时，采用Goni法所测定的结果均比100 mg样品的小，这可能是由于Goni法对酶活力、酶的用量、酶的种类未做出具体的要求.这也说明当对400 mg的样品进行测定时，酶用量不足.在AOAC法中，当对400 mg样品进行测定时，没有出现含量降低的现象，这也充分证明在对100 mg样品进行测定时，其酶的用量是足量的.

2.5 测定步骤的比较

2.5.1 AOAC法和Goni法的比较

AOAC法和Goni法在测定抗性淀粉含量时，相同点都是先去除可溶性淀粉，然后水解抗性淀粉，再测定抗性淀粉中还原糖的含量，最后换算成抗性淀粉的含量.但Goni法在去除可溶性淀粉前需先去除蛋白质，同时二者在酶的使用方面存在很大的区别，见表6.

表6 AOAC法和Goni法的比较

AOAC法和Goni法水解可溶性淀粉时都是在37℃条件下连续振荡16h，这样可以充分水解可溶性淀粉中的慢速淀粉，但是AOAC法通过两种酶的联合作用会水解得更彻底，Goni法由于未使用葡萄糖淀粉酶可能会导致可溶性淀粉水解不彻底，有可能导致测定结果偏高.另外，AOAC法在溶解抗性淀粉时，应确保边加入KOH边剧烈搅拌样品，这样可以避免形成难溶的淀粉块，同时要使用磁力搅拌器进行搅拌，而不使用涡旋混匀器，以免淀粉乳化的发生.在水解抗性淀粉时，都使用葡萄糖淀粉酶作用一段时间，搅拌或者涡旋混匀都是为了水解得更充分.通过上述分析，AOAC法操作简单、准确性高、重复性好，故采用AOAC法处理样品.

2.5.2 GOPOD法和DNS法测定还原糖含量的比较

抗性淀粉的含量为还原糖的含量乘以0.9在GOPOD反应中，100 μg D-葡萄糖标准品的吸光度是确定的，所以，可以通过在510 nm测定样品的吸光度值，再通过比例换算，得到抗性淀粉的含量.在DNS反应中，3、5-二硝基水杨酸与还原糖经过共热后被还原成棕红色，在一定范围内，溶液的颜色与还原糖的含量成正比.测定样品在540 nm下的吸光值，经过相应的换算，就可以得到抗性淀粉的含量，但是由于受到显色剂的剂量、显色时间等的影响，导致测定结果重复性较差.

3 结论

AOAC-GOPOD法与其他方法相比，操作简单，酶用量充足，测定结果重现性较好，准确性较高，是测定木薯抗性淀粉的首选方法.

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STUDY ON RESISTANT STARCH DETERMINATION METHODS

XUE Hui1,2,ZHANG Guo-zhi1,LÜ Fei-jie2,TAI Jian-xiang2,LÜ Xiao-wen3
(1.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China; 2.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China; 3.Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)%

The resistant starch determination methods include Berry method,Englys method,Bjorck method,Champ method,Goni method,et al.Taking cassava resistant starch and resistant starch standard substance as materials,we compared the resistant starch processing methods(AOAC method and Goni method)and reducing sugar determination methods(3,5-dinitrosalicylic acid method and D-deoxyglucose method)to obtain the optimum cassava resistant starch determination method.We also studied the effects of sample amount on the determination result.The results showed that the AOAC-GOPOD method was simple in operation,and had high accuracy,good repeatability and full enzyme amount,so that the AOAC-GOPOD method was the preferred method.

cassava;resistant starch;measuring method

TS201.2

%A

1673-2383(2012)04-0057-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120829.1722.201204.57_013.html

网络出版时间：2012-08-29 05:22:00 PM

2012-02-14

国家木薯产业技术体系（CARS-12-bjlfj）

薛慧（1989—），女，山西吕梁人，硕士研究生，研究方向为新产品开发与利用.

*通信作者