泡核桃壳提取物体外抗菌实验的初步研究

2012-09-19张海珠

大理大学学报 2012年9期

张海珠，马媛，周萍

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

泡核桃（Juglans sigillata）又名漾濞核桃、茶核桃、铁核桃，系胡桃科（ Juglandaceae）胡桃属（ Juglans）植物。种植较广泛，主要分布于云南〔1〕、贵州、四川西部等，生长于海拔1300～3300 m山坡或山谷林中〔2〕。核桃取仁后的副产物即为核桃壳，其质地坚硬，常被作为废物弃掉或焚烧，造成了资源的极大浪费，其利用价值极低。为使这一生物资源得到有效利用，学者们从多方面对它的应用价值进行研究，取得了一定成果，如制造活性炭〔3-5〕、作为新能源燃料〔6〕、制造眼镜、手表等零件的清洗和抛光材料〔7〕、作为滤料、堵漏材料、有机稀释肥、抗聚剂〔8〕、催化热解制取氢气〔9〕、制备木材胶粘剂〔10〕、制造颗粒填充聚氯乙烯基复合材料可改善材料的隔声性能〔11〕等应用。并发现核桃壳具有一定的药理作用，如提取物对心肌缺血有保护作用〔12〕、木醋液有抑菌作用〔13〕等。本实验对核桃壳的提取物HTKD、HTKE、HTKF对常见致病菌的抑制作用进行了初步实验，并测定了它们的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），以期进一步开发核桃壳的药用价值，拓展其应用前景。

1 实验仪器与试药

1.1 实验仪器立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），电热恒温培养箱（萧山永发电器有限公司沪南实验仪器厂），隔水式恒温培养箱（上海-恒科技有限公司、上海-恒科学仪器有限公司），SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2 实验试药 MH（A）培养基、MH（B）、沙氏琼脂培养基、液体沙氏琼脂培养基、琼脂粉等均由北京奥博星生物技术有限责任公司提供。绿脓杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、白色念珠菌均由大理学院基础医学院病原微生物教研室提供。泡核桃采集自云南省大理州漾濞县，由大理学院生药学教研室周浓副教授鉴定为胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans）植物泡核桃（ Juglans sigillata）。

2 实验方法

2.1 泡核桃提取物原液的配制泡核桃壳经10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸调pH为中性，加2、4、6倍乙醇沉淀得到HTKD、HTKE、HTKF提取物。精密称取HTKD、HTKE、HTKF组分，用蒸馏水溶解，配制成浓度为250 mg/mL、333.3 mg/mL、200 mg/mL的药物原液，灭菌后备用。

2.2 供试菌混悬液的制备将6种细菌菌落（遵循少量多次的原则）置于约2 mL生理盐水中，混匀，与0.5麦氏比浊管比对，相同后用液体肉汤/沙氏培养基稀释3次，使含菌量约为0.5×106CFU/mL，作为供试菌混悬液。

2.3 核桃壳提取物MIC和MBC的测定〔14〕

2.3.1 MIC的测定将三种组分药物原液用试管稀释法进行倍比稀释为10管，过滤后，按浓度从低到高的顺序依次吸取100 μL加入到96孔板的相应孔中，再向此些孔中加入100 μL菌液（浓度为0.5×106CFU/mL），置37 ℃恒温培养箱中培养24 h〔15〕。板中可用肉眼观察到有浑浊的孔表示有细菌生长，每行最后一个澄清的孔中的药物稀释浓度即为该药物的MIC。

2.3.2 MBC的测定取MIC测定中无细菌生长孔中的混合液各100 μL注入琼脂培养基，用涂布法展开，放入37℃恒温培养箱培养24 h，以菌落数不超过5个的平板所对应的小试管的最低药物浓度为该药物的最低杀菌浓度（MBC）。

2.4 对照实验空白对照：200 μL液体培养基，药液和菌液均不加；阴性对照：液体培养基100 μL加稀释后最小浓度的药液100 μL，不加菌液；阳性对照：液体培养基100 μL，加相应的菌液100 μL，不加药液。

3 结果

3.1 核桃壳HTKD、HTKE、HTKF三种组分的抗菌实验结果（表1～3）

表1 核桃壳HTKD组分的抗菌实验结果

表2 核桃壳HTKE组分的抗菌实验结果

表3 核桃壳HTKF组分的抗菌实验结果

3.2 核桃壳HTKD、HTKE、HTKF三种组分的MIC及MBC （表4～5）

表4 核桃壳提取物对8种细菌的MIC

表5 核桃壳提取物对8种细菌的MBC

4 讨论

本实验采用微量稀释法进行泡核桃壳提取物HTKD、HTKE、HTKF组分进行MIC、MBC的测定，对了解泡核桃壳提取物有无抗菌作用、抗菌效果如何、确定用药剂量和研究抗菌机理等方面具有重要意义。实验结果表明泡核桃壳HTKD、HTKE、HTKF三种组分对绿脓杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、白色念珠菌等8种临床常见致病菌均有一定的抑制或杀灭作用。虽然此实验呈现了一定的结果，但是体外抗菌实验的环境与体内不同，所以这些提取物还需要进一步通过动物体内实验来证明其抗菌作用，进而为开发核桃壳的抗菌药用价值奠定基础。

近年来，不合理使用抗生素导致耐药菌逐渐增多，这些细菌的感染严重威胁人类的健康。但细菌较少对抗菌中药产生耐药，研究和开发抗菌中药对解决耐药细菌的产生具有重要意义〔16〕。本实验研究的泡核桃壳具有来源广泛、费用低等优点，对其进行抗菌成分及机理的研究，通过建立动物模型，设定客观的评价标准，为其今后在临床应用提供科学依据。

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