眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织ICAM-1表达的影响

井 欢 王守岩 王 健 王 莹 高 原 潘 茜 于 丹 王 哲 关洪全

(辽宁中医药大学基础医学院病理教研室，辽宁 沈阳 110847)

眼针疗法是我院著名老中医彭静山教授于70年代始创，是以眼眶周围穴区为针刺点防治疾病的一种微针疗法。临床30余年的实际应用显示，眼针对多种急慢性疾病具有很好的疗效，特别是对急性脑缺血性疾病效果突出。细胞间黏附因子1(ICAM-1)是最重要的白细胞-内皮细胞间黏附分子之一，在脑缺血再灌注损伤中的作用成为急性缺血性脑卒中研究的热点。近年来的研究已经证实脑缺血再灌注损伤后在缺血受损区有免疫细胞因子的过量表达和炎性细胞浸润，过量炎症因子的产生能加重神经细胞损伤〔1〕。本实验通过建立大鼠急性脑缺血再灌注损伤模型，观察眼针对脑组织ICAM-1表达的影响，旨在探讨眼针治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康SPF级SD大鼠64只，雌雄不拘，体重(280±20)g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证编号:SCXK(京)2007-0001。适应性喂养1 w，自由饮水，摄取标准颗粒饲料，室内温度22℃，相对湿度45%。按随机数字法将大鼠分为对照组、假手术组、模型组、眼针组，每组16只。

1.2 方法

1.2.1 模型制备与评价 参照文献〔2〕，模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。具体步骤:在室温 (22℃)条件下，大鼠用 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部消毒后正中偏右0.5 cm处纵向切开2 cm切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。其中ECA需暴露出3～5 mm，ICA需分离至翼腭动脉。在ECA远端距CCA分叉处3～5 mm处结扎ECA，注意结扎用的手术线不要剪断。再用电凝器在结扎点远心端电凝ECA，用眼科手术剪在结扎点和电凝点之间剪断ECA。然后将ECA向鼠尾方向牵拉，使ECA和ICA成一条直线。动脉夹夹闭CCA近心端和ICA远心端，在ECA结扎点前端剪一“V”形小口，缓慢将栓塞线经ECA插入ICA，打开ICA远心端的动脉夹。栓塞线插入深度1.8～2.2 cm。结扎ECA，逐层缝合。正常组未做处理。假手术组术式同模型组、眼针组，仅未插入钓鱼线。模型组、眼针组于缺血2 h进行再灌注，再灌注后72 h进行神经功能缺损评分。模型的评价参照ZeaLonga 5分制评分标准:0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。

1.2.2 眼针取穴及刺法 取13 mm毫针，眼针组于大鼠眶周2 mm 处针刺，定位参照人体取穴方法〔3，4〕，取肝区、上焦区、下焦区、肾区，见图1。针刺手法:从眼眶边缘1 mm部位平刺，左眼按照顺时针方向，右侧按逆时针方向，从该穴区起始定位线向终止定位线进针，进行平刺操作，刺入真皮，达到皮下组织，进针3 mm，到终止定位线为止。留针20 min，留针10 min时用刮柄进行刮针1次，刮针5下。治疗时机:眼针组于脑缺血再灌注即刻及取材前30 min分别进行眼针治疗2次。正常组、假手术组和模型组无其他处理。

1.2.3 试剂 实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物。ICAM-1引物由北京华大基因公司合成。亲和纯化兔抗鼠ICAM-1多克隆抗体、二氨基联苯胺(DAB)染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.4 指标测定 脑组织形态学观察:10%水合氯醛(3.5 ml/kg体重)腹腔麻醉，开胸暴露心脏，先以0.9%生理盐水200 ml灌至无血色后，再更换4%多聚甲醛200 ml进行灌注。开颅取脑，后固定于同一固定液中6 h，脑组织取材参照脑立体定位图谱，以Bregma点前后各0.2 mm为取材区间，常规脱水、石蜡包埋。将包埋的蜡块作5 μm切片，苏木素-伊红(HE)染色将石蜡切片，常规脱蜡、乙醇梯度脱水、HE染色，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

图1 大鼠眼针取穴示意图

脑组织ICAM-1蛋白表达(免疫组化SABC):将上述石蜡切片按免疫组化试剂盒操作。ICAM-1以细胞膜或细胞质内出现清晰棕褐色颗粒为阳性。使用BI2000医学图像分析系统对采集的图像测定阳性反应物的灰度，每例动物随机取3～4张切片，且各组所选部位相同。

脑组织ICAM-1蛋白表达(Western印迹法):以上述方法麻醉后断头取右脑梗死区半暗带，按脑组织净重∶裂解液=1∶10的比例，加入相应体积的裂解液，pH7.5，将样品剪碎后匀浆、离心，上清即为总蛋白。兔抗鼠ICAM-1一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate显色;扫描仪扫描硝酸纤维素膜(NC膜)，分析结果。

脑组织ICAM-1 mRNA的表达:采用RQ-PCR方法，ICAM-1上游引物:5'CAAACGGGAGATGAATGG 3';下游引物:5'CACGAAGCCCGCAAT3'。β-actin为内参，其上下游引物分别为:5'CGTGCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCGATAGTGATGACCT 3'。所有的产物在ABI Prism 7500 HT序列检测系统中运行。读取CT值，以管家基因β-actin为内参，以扩增倍数作为比较的依据，△CT=CT目的基因 -CTβ-actin，△△CT=△CT实验-△CT对照，扩增倍数=2-△△CT。将所扩增的PCR产物同时进行溶解曲线分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件，实验数据采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织形态结构的影响 正常组及假手术组大鼠皮层组织细胞排列有序，细胞结构完整，核清楚，组织间隙无异常。模型组神经细胞数量明显减少，可见筛网状坏死灶，坏死灶周围部分区域胞体增大，染色变淡，细胞周围水肿明显，组织结构疏松，可见中性粒细胞浸润。眼针组缺血神经元数目减少，组织结构水肿减轻，中性粒细胞浸润较模型组减少。

2.2 眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织ICAM-1蛋白表达的影响 采用免疫组化方法，模型组右侧额顶叶脑组织ICAM-1阳性细胞较正常组和假手术组增加，而眼针组ICAM-1阳性细胞较模型组减少(P＜0.01)。采用Western印迹方法，模型组脑组织ICAM-1蛋白表达明显高于正常组和假手术组，眼针组ICAM-1蛋白表达明显低于模型组(P＜0.01)。见图2，表1。

图2 眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织ICAM-1蛋白表达的影响(SABC法，×400)

表1 眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织ICAM-1蛋白表达影响(±s，n=8)

表1 眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织ICAM-1蛋白表达影响(±s，n=8)

与正常组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01

组别 免疫组化法(灰度值) Western法(灰度值)114.78±13.54 0.35±0.02假手术组 121.65±12.55 0.37±0.04模型组 157.36±15.13 0.60±0.041)眼针组 136.41±19.382) 0.52±0.042)正常组

2.3 眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织ICAM-1 mRNA表达的影响 选用β-actin作为内参，ICAM-1基因扩增产物大小为86 bp，β-actin基因扩增产物为132 bp。模型组脑组织ICAM-1 mRNA表达(3.9±0.37)较正常组(1.00±0.09)、假手术组(1.46±0.26)增加，眼针组表达(1.8±0.23)较模型组减少，均有显著差异(P＜0.01)。

3 讨论

眼针疗法是彭静山教授根据中医学“诸经皆属于目”以及在后世医家的“五轮”“八廓”理论基础上，结合“八卦”学说，按照八卦方位将眼眶四周分为等份的八个区，每个区代表一个卦位，即乾、坎、艮、震、巽、离、坤、兑;在八区的基础上再依据经络脏腑的联属关系配以脏腑穴区，总计十三穴区，即肺穴、大肠穴、肾穴、膀胱穴、上焦穴、肝穴、胆穴、中焦穴、心穴、小肠穴、脾穴、胃穴、下焦穴〔5〕。脑为奇恒之府，脑由髓汇集而成，故名“髓海”，脑是精髓和神明高度汇集之处，有元神之府。眼与脑密切相连。……目形类丸，……内有大络六，谓心、肺、脾、肝、肾，命门各主其一;中络八，谓胆、胃，大小肠，三焦、膀胱各主其一;外有旁支细络莫知其数，皆悬贯于脑……〔6〕。说明眼通过经络与脑密切相连。在辨证基础上选取相应穴位进行针刺，从而达到“通经调气血”以防治疾病的效果。30余年来临床上运用眼针治疗重疾顽症，特别是对急性脑卒中瘫痪的疗效尤为明显。

ICAM-1属免疫球蛋白超家族成员，与白细胞的浸润关系密切，可促进炎症反应的发生。ICAM-1介导白细胞与血管内皮细胞之间的黏附及白细胞穿过血管壁这一复杂过程。正常情况下ICAM-1可以在内皮细胞有低水平的表达，不会引起机体的病理性损伤;而在脑缺血等病理情况下，在细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)等刺激下表达可明显升高，一旦缺血区域血流恢复，ICAM-1即可作为配基与白细胞上表达的淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和巨噬细胞活化趋化因子-1(Mac-1)结合，使大量白细胞与微血管内皮细胞发生黏附，且穿越血管内皮细胞到达周围组织产生炎症反应，进而引起一系列的病理变化，导致再灌注损伤〔7，8〕。本实验结果显示模型组大鼠脑组织ICAM-1蛋白和基因表达均较正常组、假手术组升高，同时神经功能缺损症状加重，说明ICAM-1参与了脑缺血再灌注损伤。而眼针治疗后ICAM-1蛋白和基因表达均较模型组下降，说明眼针能减少脑缺血再灌注损伤大鼠ICAM-1表达。即通过眼针治疗可以有效地减少脑梗死区ICAM-1的表达，通过减轻炎症反应实现对脑细胞损伤的保护作用。

1 Merrill JE，Benveniste EN.Cytokines in inflammatory brain lesions:helpful and harmful〔J〕.Trends Neurosci，1996;19(18):331-8.

2 马贤德，孙宏伟，柴继严，等.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中华中医药学刊，2009;27(6):1200-1.

3 彭静山.眼针疗法〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社，1990:11.

4 田维柱.中华眼针〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社，1998:78-88.

5 董文毅，彭 敏.眼针疗法的研究进展〔J〕.针灸学报，1991;3(1):48-51.

6 明·王肯堂.证治准绳〔M〕.北京:中国中医药出版社，1997:226.

7 Rigsby CS，Ergul A，Portik-Dobos V，et al.Dorrance.Effects of spironolactone on cerebral vessel structure in rats with sustained hypertension〔J〕.Am J Hyperten，2011;24(6):708-15.

8 Ishida H，Takemori K，Dote K，et al.Expression of glucose transporter-1 and aquaporin-4 in the cerebral cortex of stroke-prone spontaneously hypertensive rats in relation to the blood-brain barrier function〔J〕.Am J Hyperten，2006;19(1):33-9.