索曼染毒对大鼠脑组织乙酰胆碱受体m1和m4 mRNA表达的影响

康健捷 刘 雁 徐海伟 (广州军区广州总医院神经内科，广东 广州 5000)

索曼(O-1，2，2-trime thylpropy1 methylphosphonofluoridate)属有机磷酸酯类化合物，与对硫磷、乙拌磷等农用杀虫剂有相似的化学结构，长期接触小剂量有机磷化合物可导致人学习记忆认知功能下降，索曼挥发度适中，易于分散，可通过皮肤和呼吸道双途径吸收引起全身中毒〔1〕。作为强烈的胆碱酯酶(AChE)抑制剂，大剂量急性染毒时，索曼通过迅速不可逆地抑制神经突触中的AChE引起乙酰胆碱(Ach)大量堆积，从而导致中枢和外周胆碱能神经过度刺激而产生临床症状〔2，3〕。慢性小剂量索曼染毒可在无明显躯体胆碱能过度刺激症状的情况下导致脑损害，出现学习记忆能力下降〔4〕，在中枢神经系统中，突触后膜Ach受体m1在学习记忆等认知功能和海马及皮层的长时程增强(LTP)过程中起重要作用〔5〕，神经末梢的突触前膜Ach受体m4对Ach的释放进行负反馈调节。本实验采用RT-PCR方法，观察小剂量索曼染毒对大鼠海马及前额叶皮层Ach受体m1和m4 mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组与模型建立 雄性健康Wistar大鼠，24只，体质量(180±30)g，由第三军医大学实验动物所提供。随机分为生理盐水对照组、半数致死量对照组、6 μg/kg染毒组和10 μg/kg染毒组，每组 6 只。6 μg/kg染毒组和 10 μg/kg染毒组每天上午背部皮下注射一次索曼，剂量分别分6 μg/kg(相当于 0.06 LD50)和 10 μg/kg(相当于 0.1 LD50)，共 14 d。生理盐水对照组每天注射相同体积的生理盐水。末次给药后第2天，取大鼠脑组织用于检测Ach受体m1和m4 mRNA表达水平;半数致死量对照组大鼠取样前注射一次索曼，剂量分100 μg/kg(相当于 LD50)。

1.2 RT-PCR检测小剂量索曼染毒对大鼠脑组织Ach受体m1和m4 mRNA表达的影响 实验所需试剂及器材预先经过焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理。末次给药第2天上午将大鼠断头处死，于冰台上分离出海马和前额叶皮层各10 mg，取同组6例共60 mg，加入1 ml Tripure，用玻璃匀浆器充分匀浆;提取总RNA、检测RNA浓度和纯度、逆转录酶反应、多聚酶链反应。引物设计:从 GenBenk(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/nucleoyide.htlm)中调取大鼠Ach受体m1、m4和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)完整 cDNA序列，以此为参照，通过网站(www.genome.wi.mit.edu)提供的引物设计程序，设计出PCR引物序列。通过同源性比较(http://www.ncbi.nih.gov/blast)均为特异引物，送上海Bioasia公司合成。根据扩增条带的位置和荧光强度，判断扩增产物大小。将处理组与对照组比较，观察荧光强度的OD值，增强为表达上调，反之为下调。实验结果重复3次以上。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件进行分析，采用单因素方差检验，计量资料均以±s表示。

2 结果

在14 d给药期间生理盐水对照组、6 μg/kg染毒组、10 μg/kg染毒组大鼠均未发现有惊厥、死亡现象，10 μg/kg染毒组有轻微腹泻现象。半数致死量对照组(100 μg/kg)大鼠均出现惊厥，其中2只死亡。

半数致死量对照组(100 μg/kg组)大鼠海马和前额叶皮层Ach受体m1和m4 mRNA表达均与生理盐水对照组无显著差别。小剂量染毒组(6 μg/kg组和10 μg/kg组)大鼠前额叶皮层Ach受体m1 mRNA表达均显著低于生理盐水对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);海马Ach受体m1 mRNA表达略低于生理盐水对照组，但组间无差异(P＞0.05)，前额叶皮层和海马Ach受体m4 mRNA表达均显著高于生理盐水对照组(P＜0.05)，其中10 μg/kg组大鼠前额叶皮层 Ach受体 m4 mRNA表达与生理盐水对照组相比差异显著(P＜0.01)。在生理盐水对照组和半数致死量对照组间Ach受体m1 mRNA和m4 mRNA均无显著差别(P＞0.05)。见表1，图1，图2。

表1 索曼染毒大鼠海马和前额叶皮层Ach受体m1和m4 mRNA的变化(OD乙酰胆碱受体m1(乙酰胆碱受体m4)/ODGAPDH)(±s)

表1 索曼染毒大鼠海马和前额叶皮层Ach受体m1和m4 mRNA的变化(OD乙酰胆碱受体m1(乙酰胆碱受体m4)/ODGAPDH)(±s)

与生理盐水对照组比较:1)P＜0.05;2)P＜0.01，与半数致死量对照组比较:3)P＜0.05

±0.046组别 n 乙酰胆碱受体m1海马 前额叶皮层乙酰胆碱受体m4海马±0.025 6 μg/kg染毒组 6 0.275±0.022 0.250±0.0161)3) 0.627±0.0301)3) 0.364±0.0311)3)10 μg/kg染毒组 6 0.270±0.019 0.247±0.0181)3) 0.671±0.0741) 0.426±0.0662)半数致死量对照组 4 0.289±0.029 0.277±0.028 0.531±0.054 0.271前额叶皮层生理盐水对照组 6 0.294±0.027 0.287±0.021 0.528±0.031 0.274

图1 各组大鼠海马(左图)和前额叶皮层(右图)Ach受体m1 mRNA的表达(上:m1，下:GAPDH)

图2 各组大鼠海马(左图)和前额叶皮层(右图)Ach受体m4 mRNA的表达(上:m4，下:GAPDH)

3 讨论

亲酯性索曼可迅速穿过血脑屏障进入脑组织，在体内的水解非常缓慢，特别是在脑和肌肉中〔6〕。索曼持续不可逆地抑制AchE，并使之老化，导致Ach降解减弱，造成脑组织Ach大量堆积。既往的研究采用Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力，结果显示慢性小剂量索曼染毒可抑制大鼠学习记忆的获得与巩固过程，降低已储存记忆的读出或提取能力〔4〕。现有理论认为:脑内胆碱能受体的增减受Ach含量的调控，Ach含量高则胆碱能受体数量下降，反之则升高。AchE能迅速催化Ach的水解，是Ach水解的主要方式，AchE活性的变化可直接反映Ach的代谢情况，从而在一定程度上体现胆碱能系统的功能状况。因此，研究有机磷中毒对胆碱能系统的影响时，常选用测定AchE的活性来反映胆碱水平。以往的研究证实:大鼠连续14 d皮下注射小剂量索曼，其海马和前额叶皮层的AchE活性明显下降，对Ach的降解作用减弱，造成与认知记忆功能密切相关脑区Ach大量堆积〔4〕。

Ach受体M受体亚型m1和m4的mRNA和蛋白在海马和额叶皮层均有较高表达。本实验观察到慢性小剂量索曼染毒大鼠前额叶皮层Ach受体m1 mRNA表达与生理盐水对照组相比明显降低。推测大量堆积的Ach长期过度刺激突触后膜的Ach受体，导致Ach受体m1在基因水平转录减少，从而可能导致Ach受体蛋白水平下降。而胆碱能系统与认知记忆功能密切相关，尤其是海马和前额叶皮层，研究证实突触后膜Ach受体m1下降，胆碱能系统功能下降，可导致认知功能障碍，并抑制海马及皮层的LTP〔7〕。以往的研究显示慢性小剂量索曼染毒可降低海马LTP诱出率，降低群峰电位(PS)增加幅值〔8〕，提示索曼可降低海马突触可塑性。因此，索曼可能从基因水平下调Ach受体m1，降低海马突触可塑性和胆碱能系统功能，从而导致大鼠学习记忆能力降低。

在中枢神经系统中，Ach受体m4在突触前膜，当突触间隙Ach增高时，m4受体则上调，以减少Ach的释放。所以，突触前膜Ach受体m4对Ach释放起到负反馈调节作用。既往研究表明Ach受体m4上调与学习记忆障碍有密切关系〔5〕。本研究结果显示:两组小剂量染毒大鼠海马和前额叶皮层Ach受体m4 mRNA表达均明显增加，且在AchE抑制率和Ach受体m4 mRNA表达增加程度上表现一致，即较大剂量的索曼较高程度地抑制AchE活力，导致Ach受体m4亚型在转录水平表达加强程度更高。而半数致死量对照组大鼠Ach受体m4 mRNA表达均与生理盐水对照组无显著差别，提示小剂量染毒组大鼠脑组织Ach受体m4 mRNA表达增加是索曼慢性作用的结果，而Ach受体m4 mRNA表达增加必导致对Ach的负反馈调节作用增强，逐渐降低突触前膜对Ach的释放，从而导致神经中枢胆碱能系统功能下降。

基于以上阐述，慢性小剂量索曼染毒可导致突触后膜Ach受体m1从基因水平下调，而突触前膜Ach受体m4从基因水平上调，以加强对Ach释放的负反馈调节作用，从而导致神经中枢胆碱能系统功能下降，这可能是大鼠学习记忆能力下降的结构基础。但有关索曼染毒致认知功能障碍的实验研究，还需要从与认知功能有关的M受体亚型的蛋白水平及其他胆碱受体亚型基因水平等方面进一步证实。

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6 Li JT，Ruan JX，Zhang ZQ，et al.Effects of pretreatment with verapamil on the toxicokinetics of soman in rabbits and distribution in mouse brain and diaphragm〔J〕.Toxicol Lett，2003;138(3):227-33.

7 Armstrong DL，Osaka T，Murphy MR，et al.Blockade of hippocampal long-term potentiation following soman pretreatment in the rat〔J〕.Brain Res Bull，1997;43(1):117-20.

8 康健捷，黎海蒂，徐海伟，等，小剂量梭曼对大鼠学习记忆和海马脑片LTP的影响〔J〕.第三军医大学学报，2003;25(3):230-2.