蕨菜孢子组织培养技术的研究1）

郭宇兰，陈宇

（黑龙江省林副特产研究所，黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江 牡丹江157011）

蕨菜〔Pteridium aquilinum （L.）Kuhn.〕，又叫拳菜、蕨儿菜、拳头菜、龙须菜、龙头菜、如意菜等，属凤尾蕨科多年生植物，多野生于阴湿浅山荒坡、半山坡及林下草地。可供食用或酿造，有较高的营养价值和经济价值。蕨菜因其风味独特，营养丰富而为人们所喜食。近年来，食用绿色食品极为风行，而蕨菜因其生长在无污染的环境中，是极其优良的绿色食品品种，因而深受国际市场的欢迎。由于对野生蕨菜的过度采集和人为活动对其生存环境的破坏，其产量逐年下降，人工种植蕨菜已经引起人们广泛关注，保护蕨菜资源，发展人工栽培技术显得十分必要。通常利用地下茎进行营养繁殖，繁殖系数低，工作强度大，难以进行大面积推广。利用组织培养技术快繁种苗是满足蕨菜生产的关键。该研究利用蕨菜孢子培养，成功获得大量的组培生根苗，且移栽成活率较高。

1 材料与方法

1.1 试验材料

来源于黑龙江省林副特产研究所采摘的蕨菜孢子，采自2012年6月黑龙江省林副特产研究所实验地，收集好后，放置4℃冰箱保藏。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌外植体的准备

将采集的蕨菜孢子用无菌滤纸包好，曲别针固定封口。将纸包置于75%的酒精中消毒30s，无菌蒸馏水清洗2次，再用0.1%的HgCl2消毒，设置60s、120s、150s、180s消毒处理，无菌水清洗洗4～5次，然后用滴管吸取孢子溶液，滴于MS培养基中。每个处理20瓶，3次重复，3d后开始调查污染率，之后每早调查1次，10d后结束调查。

1.2.2 培养条件

本实验采用MS为基本培养基，附加2%蔗糖，0.5%琼脂，pH5.8～6.0，植物生长调节剂在灭菌前加入。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌30min。培养室温度控制在（25±2）℃，光强为2500～3000 lx，光周期为光培养16h，暗培养8h。

1.2.3 诱导培养

将外植体接种于 MS、1／2MS、1／4MS培养基中，培养条件同上，每个处理20瓶，9次重复。7d天后开始观察和调查原叶体的生长情况。

1.2.3 增殖培养

将D 0.5cm原叶体接种到不同附加物的8组培养基进行培养，培养条件同上，观察培养物分化状况。每个处理20瓶，9次重复。7d天后开始观察并记录生长状况。

1.2.4 生根诱导

继代增殖培养后，当试管苗长度有85%以上超过2cm时，取生长旺盛的试管苗进行生根培养，生根培养基为1／2MS＋NAA（0～0.1）mg／L＋IBA（0.1～0.2）mg／L。长度过小的转接到继代培养基上继续进行扩繁培养，以提高材料的利用率。每种处理20瓶，重复9次，30d后统计生根率、根长。

1.2.5 练苗与移栽

当根长4～6cm左右，生长健壮时进行驯化移栽。首先在培养室打开瓶盖放置5d，然后用镊子从瓶内取出植株，用自来水冲洗净附着在根部的培养基，移栽到营养钵中（土∶沙∶腐熟土有机肥＝1∶1∶0.5），套袋保湿，大约一周后，长出新叶，可以去掉遮盖，放到温室进行管理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对外植体成活率的影响

表1 不同消毒时间对蕨菜孢子成活率的影响

表1结果表明，随着升汞消毒时间的增加，污染率降低，但虽然升汞的消毒效果很有效，却对外植体的活化和分化等方面产生了一定的影响。由表1可看出：70%的酒精处理30s后，再用0.1%HgCl2处理150s最合适蕨菜孢子消毒。

2.2 不同浓度无机盐对孢子萌发及原叶体形成的影响

1周后显微镜下可观察到孢子大量萌发，并逐渐形成丝状体和片状体，1个月后可形成D 0.4cm左右的原叶体。

表2 不同无机盐浓度下的孢子萌发情况

由表2可知，蕨菜孢子萌发与无机盐浓度高低有关，浓度高时抑制孢子萌发，而浓度过低则不利于孢子萌发。适当的无机盐浓度则有助于孢子萌发及原叶体形成。

2.3 不同激素水平对原叶体增殖的影响

将原叶体分切成0.5cm的原叶体小块接种到1／2MS＋6－BA（0.5～2.0）mg／L＋NAA（0.05～0.1）mg／L的培养基中，2个月后统计增殖情况。

表3 不同激素水平对原叶体增殖的影响

根据增殖质量和数量来评价激素配比的状态，从而选出最佳激素配比的培养基。由表3可以看出，3号培养基最合适原叶体的增殖培养。

2.4 不同浓度的生长素对壮苗生根的影响

表3 不同浓度的IBA与NAA组合对试管苗生根的影响

由表3可以看出，试验蕨菜孢子苗生根培养是以1／2MS为基本培养基，在9种培养基中，小苗均能生根，生根率在5号培养基中最高，达98.6%，生根最快，根系发达、粗壮，且组培苗生长良好，叶片浓绿，小苗长势较为旺盛，均长有4条以上长度超过7cm的根，且健壮，此时即可出瓶移栽。

2.3 试管苗移栽

当根长2～3cm时进行驯化移栽。首先在培养室将打开瓶盖放置一周，然后用镊子从瓶内小心取出植株，出瓶时要小心不要伤到根，用自来水冲洗净附着在根上的培养基，阴凉处晾干表面水分。移栽到营养钵中（土∶沙∶腐熟土有机肥＝1∶1∶0.5），套袋保湿，第1次浇足水后，1周内不浇水，经常向小盆周围的地上洒水，保持空气湿度80%～90%，通风，大约一周后，长出新叶，可以去掉遮盖，放到温室进行管理，成活率可达95%以上。

3 结论与讨论

本试验用无菌滤纸打包的方法进行孢子灭菌，操作简单，节省时间。试验表明，蕨菜孢子的适宜灭菌方法为：用70%酒精灭菌30s，无菌蒸馏水清洗2次，再用0.1%的HgCl2消毒150s，无菌水清洗洗4～5次。增殖培养基为1／2MS＋6－BA1.5mg／L＋NAA 0.05mg／L。生根培养基为1／2MS＋NAA 0.05mg／L＋IBA0.2mg／L，生根率可达98.6%，均长有4条以上长度超过7cm的根。将长势佳的试管苗进行移栽，成活率可达95%。