自制中药正元芸生滴丸质量标准的实验研究

王淑霞 支晨阳 高冬梅 戈亚平 楚建设 高雁

糖尿病患者因糖代谢障碍致全身各组织器官的微血管发生病变，糖尿病性视网膜病变(简称糖网)是其最常见的并发症。根据中华医学会眼科专业委员会眼底病学组制定的标准，分为单纯型和增殖型。对于增殖型患者临床中常采用激光和手术治疗，而对于单纯型患者，临床多用药物治疗，其疗效不甚明确。在前期研究中，我们研制的正元芸生滴丸的提取工艺、滴丸的制备均符合临床要求及药典规定，我们继续对其成分含量和稳定性进行实验研究，现将研究结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 正元芸生滴丸质量标准研究

1.1.1 性状:本品应为棕褐色滴丸，表面光洁，不得粘连。

1.1.2 薄层鉴别

1.1.2.1 当归 取本品3 g，加乙醚20 ml，超声15 min，滤过，低温蒸去乙醚，残渣用醋酸乙酯1 ml溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液再取缺当归样品，同法制备阴性样品溶液。吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷一乙酸乙醋(9∶1)为展开剂展开、取出、晾干，置紫外光灯(365 nm)下，观测对比三种溶液色谱。

1.1.2.2 川芎 取本品5 g，加水50 ml使溶散，加乙醚提取3次，每次50 ml，水液备用，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材0.5 g，加乙醚30 ml超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿0.5 ml使溶解，作为对照药材溶液。再取缺川芎样品，同法制备阴性样品溶液。吸取上述各4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开、取出、晾干方法同前，置紫外光灯(365 nm)下检视。观测对比三种溶液色谱。

1.1.2.3 桃仁 取本品4 g，加甲醇20 ml，密塞，超声提取20 min，滤过，滤液水浴浓缩至1 ml，作为供试品溶液;另取桃仁对照药材2 g、缺桃仁的阴性样品4 g，同法分别制桃仁对照药材溶液和阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(6∶4∶0.3)为展开剂展开、取出、晾干，喷以5%香草醛显色剂观察。

1.1.2.4 红花 取本品10 g，用80%的丙酮水50 ml冷浸提取4 h后滤过，残渣续用80%的丙酮水20 ml冷浸提取2 h后滤过，合并2次滤液，55℃下0.1 MPa真空蒸干，残渣以10 ml 70%的乙醇水超声溶解，上NKA大孔吸附树脂柱(130 g，3.5 cm×20 cm)，用300 ml水洗脱，弃去水洗液，再用500 ml的30%乙醇水洗脱，收集30%乙醇水洗脱液，55℃下0.1 MPa真空蒸干，残渣用80%丙酮水溶解并定容至5 ml，作为供试品溶液。按处方除去红花配置成红花阴性样品，同上法制成阴性溶液。另取红花对照药材0.5 g，以5 ml 80%丙酮水分3次于振荡机中中速振摇提取20 min，合并上清液浓缩并定容至5 ml，作为对照药材溶液。参照方法同上，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以甲醇-36%盐酸(1∶1)为展开剂展开、取出、晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。

1.1.2.5 牛膝 对照品溶液的配制:取齐墩果酸对照品，加乙醇制成1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。样品溶液的配制:取本品约11 g，加乙醇30 ml，加热回流40 min，静置，滤过，取滤液，加盐酸3 ml，加热回流1 h，浓缩至5 ml，加水10 ml，用石油醚(60℃ ～90℃)20 ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加乙醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。空白溶液的配制:按处方工艺提取并制备牛膝缺样空白样品，取适量(相当于本品11 g)，按样品溶液制备方法得到缺样空白溶液。分别吸取供试品溶液、缺样空白溶液和对照品溶液各10 μl，分别点样于同一硅胶H薄层板上，以氯仿2甲醇(40∶1)为展开剂展开、取出、晾干。喷以磷钼酸试液，热风吹至斑点清晰，观察对比三种溶液色谱。

1.1.2.6 生地黄 取本品3 g，加70%乙醇30 ml超声20 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水30 ml溶解，过滤后加硫酸2 ml，搅匀。用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20 ml，弃去碱液，继用正丁醇饱和的水洗至中性，正丁醇水浴蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，得供试品溶液。取生地黄药材粉末3 g，100 ml水回流1 h，过滤浓缩至50 ml用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20 ml，弃去碱液，继用正丁醇饱和的水洗至中性，正丁醇水浴蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，得对照药材溶液。取除生地黄以外的其他药材，按照样品制备工艺制成阴性对照样品，取阴性对照样品，按供试品溶液处理方法制成阴性对照溶液。吸取上述溶液各20 μl，分别点于同一块硅胶G板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(20∶2∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%三氯化铝溶液，紫外光灯(365 nm)下检视，观察对比三种溶液色谱。

1.1.3 含量测定

1.1.3.1 色谱条件 色谱柱:ReliaSil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.1% 磷酸(13:87);流速:0.7 ml/min;检测波长:233 nm;柱温:室温。

1.1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品6.25 mg，置5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1 ml含0.25 mg芍药苷)。

1.1.3.3 供试品溶液的制备 取本品2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，称定重量，放置2 h，超声处理1 h，冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液20 ml，置于100 ml溶量瓶中，用甲醇定容，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液。

1.1.3.4 阴性对照品溶液的制备 取缺赤芍的样品2.0 g，照供试品溶液的制备项下同法操作。

1.1.3.5 线性关系考察 精密吸取芍药苷对照品溶液(0.25 mg/ml)2、4、6、8、10 μl分别注入液相色谱仪，依法测定，根据对照品的峰面积积分值对芍药苷的进样量绘制标准曲线，计算回归方程。

1.1.3.6 方法学考察 ①精密度试验:分别吸取5 μl的对照品溶液，重复进样5次，测量计算其峰值面积。②稳定性试验:精密吸取对照品溶液 5 μl，于 0、2、4、24、36 h 分别依法测定。③重现性实验:精密称取同一批样品5份，按供试品溶液的制备和测试方法测定峰面积RSD。④回收率试验:精密称取已知样品含量(8.79 mg/g)的样品5份，分别加入芍药苷对照品一定量，按正文2项下操作，测定并根据样品含量及芍药苷对照品加入量，计算回收率。

1.1.3.7 样品测定 经过多次试验，现本品中芍药苷含量暂定为每克不得低于8.47 mg。

1.1.4 检查 参照《中华人民共和国药典》制定本品的检查项目。本次实验考察的检查项主要包括溶散时限(应在30 min内全部崩解并通过筛网)和微生物限度(细菌总数≤1 000个/g，真菌总数≤100个/g，大肠埃希菌和活螨不得检出)。

1.2 正元芸生滴丸稳定性研究 将三批样品采用塑料瓶包装，在室温条件下留样观察(25℃ ±2℃，相对湿度RH60% ±5%)，当月考察1 次，以后第1、2、3、6、9、12 月依次考察一次，考察项目为质量标准中关键项目。

1.2.1 性状 本品应为棕褐色滴丸，表面光洁，不得粘连。

1.2.2 鉴别 按本品质量标准中的鉴别项下方法进行薄层色谱鉴别试验。

实验表明，三批供试品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，供试品均在与对照药材对应处有相应斑点。

1.2.3 检查 参照《中华人民共和国药典》制定本品的检查项目。本次实验考察的检查项同一。

1.2.4 含量测定 按本质量标准中的“含量测定”项下方法操作，测定不同时期样品中芍药苷的含量，本品中芍药苷含量应每克不得低于8.47 mg。

2 结果

当归、川芎、桃仁、红花、生地黄和牛膝薄层鉴定结果:在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。阴性对照溶液无干扰;三批样品稳定性研究外观性状考察结果:三批供试品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，均为棕褐色滴丸，表面光洁，不粘连。

表1 三批样品稳定性研究溶散时限考察结果

三批样品稳定性研究微生物限度考察结果:实验表明，三批供试品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，溶散时限和微生物限度均符合规定。

表2 三批样品稳定性研究芍药苷含量考察结果

实验表明，三批供试品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，样品含量均符合规定。

在含量测定研究中，芍药苷对照品进样量绘制标准曲线，计算回归方程，结果:Y=8.3421×104X+3.1723×103，r=0.99996。表明:芍药苷在0.05～0.25 μg之间呈良好的线性关系;精密度试验中测得其峰面积RSD为1.38%。稳定性试验中测得峰面积RSD为1.03%，芍药苷在30 h内结果稳定。重现性实验中测得其峰值面积RSD为1.74%。回收率试验中测得其平均回收率为98.96%，RSD为0.8%(n=5)。

3 讨论

正元芸生滴丸是有效治疗糖尿病视网膜病变的中药滴丸［1-4］，在前期的实验研究中我们证实了该制剂的提取工艺、滴丸的制备均符合临床要求及药典规定。本项研究采用薄层色谱法对制剂中的当归、川芎、桃仁、红花、牛膝、桔梗、生地黄进行了定性鉴别;采用高效液相色谱法对制剂中的芍药苷进行了定量分析。研究结果:薄层色谱斑点清晰，阴性对照无干扰;芍药苷在0.05～0.25 μg之间呈良好的线性关系。平均回收率为98.96%，RSD为0.8%(n=5)。研究结果证实本方法实用可靠，可以用于正元芸生滴丸的质量控制。

［1］于兰英，于红.正元芸生胶囊对实验性静脉阻塞的影响.长春中医学院学报，2005，21(4):42.

［2］辛浩蓉，支洪峰.正元芸生滴丸治疗单纯型糖尿病性视网膜病变疗效观察.长春中医学院学报，2009，25(6):877.

［3］支洪峰，高冬梅，刘馨.正元芸生胶囊治疗视网膜静脉阻塞临床观察.中国社区医师，2005，21(12).

［4］雷载权.中药学.上海科学技术出版社，1994:92-94.